大腹园蛛拖丝蛋白基因的克隆和序列分析

摘要

蜘蛛可产生七种丝和胶粘物,其化学本质均为蛋白质。其中蜘蛛拖丝将高强度和高弹性集于一体,是最优良的天然蛋白质纤维,被誉为“生物钢”。在蜘蛛拖丝蛋白质的氨基酸序列中有四个特征性的氨基酸序列motifs,这四个氨基酸序列motifs以多个数量、多种组合和多次重复的形式存在。由于构成蜘蛛拖丝蛋白基因的核苷酸序列高GC含量(局部区域可达80％),且具有大量的重复性序列,因而以基因组DNA为模板进行PCR扩增或以mRNA为模板进行RT-PCR扩增拖丝蛋白基因时,设计特异性引物是相当困难的,PCR扩增产物极易出现梯形的多条DNA带。实际扩增中由于模板和引物的竞争作用,使得基因扩增提前终止,只能得到较短的DNA片段,因而到目前为止,编码蜘蛛拖丝蛋白基因的大小尚未确定,尚未获得编码蜘蛛拖丝蛋白基因的完整克隆,蛋白表达的研究也进展缓慢。任洪林等采用构建cDNA文库的方法仅获取了大腹园蛛拖丝蛋白约1.7kb的部分编码序列;Beckwitt等进行PCR扩增双世纪园蛛的基因组DNA,仅获得了约300bp和700bp的拖丝蛋白基因片段。本论文选取大腹园蛛作为研究对象,解剖分离出大腹园蛛主壶腹腺体,提取基因组DNA和总RNA,设计合成了很多对引物,采用常规PCR、多重PCR、热启动PCR等方法进行扩增,并根据实验结果最终确定了长距离PCR反应对复杂基因的扩增。通过多种引物对实验、MgCl2浓度梯度实验、引物浓度梯度实验、退火温度梯度实验、延伸时间梯度实验、touch down循环等实验对PCR以及RT-PCR反应条件进行优化,以扩增大腹园蛛拖丝蛋白基因。凝胶纯化、回收扩增获得的大腹园蛛拖丝蛋白基因DNA,克隆于pDrive载体,筛选转化子,并经PCR、酶切和序列分析鉴定阳性克隆。将其中的一个克隆基因片段构建入pET32a(+)蛋白表达载体。本论文以DNA为模板,通过PCR扩增获得了编码大腹园蛛拖丝蛋白基因的克隆AvDS1,序列长2199bp,序列分析表明不含基因内含子;通过RT-PCR,获得了编码大腹园蛛拖丝蛋白基因的克隆AvRS2,序列长951bp;序列比较分析推测大腹园蛛拖丝蛋白基因存在着两种组分,AvRS2克隆为编码大腹园蛛拖丝蛋白基因组分-1,AvDS1克隆可能为大腹园蛛拖丝蛋白基因的另一组分-2。获得了可以表达大腹园蛛拖丝蛋白基因AvRS2的pET-RS2表达载体。这些成果有助于进一步研究大腹园蛛拖丝蛋白基因的基因组成和结构特征、为应用蛋白质剪接技术开发蜘蛛拖丝蛋白的研究提供了基因克隆,构建的表达载体为进一步研究蜘蛛拖丝蛋白基因的表达、表达蛋白的结构以及应用表达蛋白进行人工纺丝奠定了基础。

目录

摘要

ABSTRACT

第一章 绪论

1.1 蜘蛛丝蛋白的特性

1.2 蜘蛛丝蛋白基因的结构、克隆和表达的研究进展

1.3 应用前景

1.4 本论文的研究内容、目的和意义

第二章 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和载体

2.1.2 酶与试剂

2.1.3 常用试剂与培养基的配制

2.1.4 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 大腹园蛛主壶腹腺腺体的解剥分离

2.2.2 引物的设计与合成

2.2.3 不同方法提取大腹园蛛主壶腹腺基因组DNA

2.2.4 琼脂糖凝胶电泳

2.2.5 模板DNA准备

2.2.6 大腹园蛛主壶腹腺体总RNA的提取

2.2.7 聚合酶链式反应

2.2.8 反转录聚合酶链式反应

2.2.9 目的片段的琼脂糖凝胶回收

2.2.10 连接反应

2.2.11 感受态细胞的制备

2.2.12 质粒的转化

2.2.13 转化子的筛选

2.2.14 质粒的提取

2.2.15 重组质粒的鉴定

2.2.16 序列测定

2.2.17 序列分析

2.2.18 表达载体pET-RS2的构建

2.3 实验流程

第三章 结果与分析

3.1 大腹园蛛主壶腹腺体的解剖分离

3.2 大腹园蛛拖丝蛋白基因AvDS1(Araneus ventricosus dragline silk DNA 1)的克隆

3.2.1 大腹园蛛主壶腹腺体的基因组DNA的提取

3.2.2 扩增引物的设计与合成

3.2.3 聚合酶链式反应的优化

3.2.4 与载体的连接反应

3.2.5 重组质粒pD-AvDS1的PCR鉴定

3.2.6 重组质粒pD-AvDS1的酶切鉴定

3.2.7 测序结果及序列分析

3.3 大腹园蛛拖丝蛋白基因AvRS2(Araneus ventricosus dragline silk mRNA2)的克隆

3.3.1 大腹园蛛主壶腹腺体的总RNA的提取

3.3.2 引物的设计与合成

3.3.3 反转录聚合酶链式反应的优化

3.3.4 与载体的连接反应

3.3.5 重组质粒pD-AvRS2的PCR鉴定

3.3.6 重组质粒pD-AvRS2的酶切鉴定

3.3.7 测序结果及序列分析

3.3 大腹园蛛拖丝蛋白基因表达载体的构建

3.3.1 含有大腹园蛛拖丝蛋白一段基因的获得

3.3.2 重组质粒pET-RS2的获得

3.3.3 重组质粒pET-RS2的酶切鉴定

3.3.4 重组质粒pET-RS2的测序

3.3.5 表达载体的构建图

第四章 讨论

4.1 对AvDS1克隆的分析

4.2 对AvRS2克隆的分析

4.3 大腹园蛛拖丝蛋白基因两种组分的推测

4.4 大腹园蛛拖丝蛋白基因表达载体的构建

第五章 结论

1 结论

2 创新点

3 难点

参考文献

英文缩写词

在学期间参与的研究项目和发表的文章