尼龙亲和膜的制备及其在木瓜蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶抑制剂纯化中的应用研究

摘要

近年来，亲和膜色谱技术在蛋白质的分离纯化中得到了快速发展，与柱亲和色谱相比，亲和色谱具有许多优点，如流速高、分离速度快、压降低和易于规模化生产等。 本文利用尼龙膜为基质，通过甲醛活化，然后键合亲水性的多聚物壳聚糖对其进行改性。实验结果表明，尼龙膜的非特异性吸附大大降低，键合的壳聚糖含量为89.6 mg/g。 木瓜蛋白酶(EC3.4.22.2)主要存在于番木瓜的乳汁中，其应用广泛，包括细胞分离、皮革、化妆品、纺织、洗涤剂、食品等行业，传统的分离方法很难达到现代工业的纯化要求和活性，并很难规模化生产。本论文首次以染料F3GA为配基制备了一种新型的分离木瓜蛋白酶的材料，研究了其物理性能和色谱性能。实验结果表明，染料F3GA的键合量为146.1μmol/g，染料亲和膜对木瓜蛋白酶的吸附量达到235.3 mg/g。利用该亲和膜从粗酶中提取木瓜蛋白酶，纯化倍数为46.5倍。本文首次综合运用批量法和动态法以配基染料F3GA与木瓜蛋白酶之间亲和相互作用的热力学和动力学进行了深入研究，结果表明，亲和膜对木瓜蛋白酶的吸附行为满足Freundlich模型，动力学分析适合Pseudo second—order kinetics模型，热力学参数△G0，△H0，和△S0分别为—12.58 kJ/mol(298 K)，17.81 kJ/mol，和0.101 kJ/(mol K)，显示木瓜蛋白酶在尼龙亲和膜上的吸附行为是一个吸热过程，负的自由能体现了木瓜蛋白酶倾向于从溶液中吸附到尼龙膜的表面，是一个自发的过程。 另外，本论文将尼龙亲和膜纯化出的木瓜蛋白酶再次运用于亲和色谱，即以木瓜蛋白酶为配基，用于从土豆汁中分离纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂。 半胱氨酸蛋白酶抑制剂是广泛存在于动植物组织和体液中的蛋白酶抑制剂，它能与木瓜蛋白酶、组织蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶形成有力的、非共价结合的竞争性抑制，抑制他们的活性，从而保护蛋白质的二硫键不被破坏，阻止蛋白的降解。有研究表明，半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有很好的生物防御作用，能参与各种生理和病理的过程，如风湿性关节炎、肾衰竭、骨质疏松症、肿瘤的侵袭和转移等。植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂可抑制致病真菌，如赤霉菌、稻瘟病菌等的生长。本论文首次以平板尼龙膜为基质，将尼龙膜改性后键合上木瓜蛋白酶，对固载化的条件进行了优化，并对其固载化的尼龙膜的性质进行了研究，最后从土豆汁中纯化出了高纯度的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。通过实验，可以看出经过壳聚糖改性的尼龙膜可以作为一种优良的亲和膜载体，利用戊二醛作为交联剂共价连接木瓜蛋白酶的方法也是可行的，并且得到的尼龙亲和膜具有较高的反应活性。在实验条件下，尼龙膜固定木瓜蛋白酶的最佳固定化条件为：pH9.0，质量分数为0.5％的戊二醛，反应温度为45℃，反应时间为6 h，酶用量为每0.35 g干载体固定9.0ml(10 mg/ml)木瓜蛋白酶。利用制得的尼龙亲和膜从土豆汁中分离纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂，纯化倍数达7.25倍。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:图表目录、符号说明

声明

第一章绪论

1.1亲和膜色谱的发展历史及研究现状

1.1.1亲和色谱技术产生的背景

1.1.2亲和膜分离的基本原理

1.1.3亲和膜色谱的制备方法

1.1.4亲和膜色谱的应用

1.1.5亲和膜色谱的分离模型和理论研究

1.1.6亲和膜色谱分离技术的展望

1.2木瓜蛋白酶的分离纯化

1.2.1概述

1.2.2纯化方法

1.3半胱氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化

1.3.1概况

1.3.2纯化方法

1.4本论文的研究意义及内容

参考文献

第二章尼龙膜的改性及性能评价

2.1概述

2.2实验部分

2.2.1原料与试剂

2.2.2主要仪器

2.2.3实验步骤

2.2.4尼龙改性膜的物理性能测定

2.2.5尼龙改性膜的非特异性吸附性能测定

2.3结果与讨论

2.3.1水解条件对尼龙膜性能的影响

2.3.2改性尼龙膜的性能

2.4小结

参考文献

第三章尼龙亲和膜色谱法纯化木瓜蛋白酶

3.1概述

3.2实验部分

3.2.1原料与试剂

3.2.2主要仪器

3.2.3亲和膜的制备

3.2.4批量法研究木瓜蛋白酶在亲和膜上的吸附行为

3.2.5动态法研究木瓜蛋白酶在亲和膜上的吸附行为

3.2.6亲和膜的物理性能表征

3.2.7酶活的测定

3.2.8转速-流速的转换

3.3结果与讨论

3.3.1亲和膜的物理性能

3.3.2批量法研究亲和膜对木瓜蛋白酶的吸附行为

3.3.3影响木瓜蛋白酶在尼龙亲和膜上的吸附因素分析

3.3.4影响木瓜蛋白酶酶活的因素分析

3.3.5动态法研究木瓜蛋白酶在亲和膜上的吸附行为

3.3.6尼龙亲和膜色谱纯化木瓜蛋白酶的分离效果

3.4小结

参考文献

第四章尼龙亲和膜色谱法纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂

4.1概述

4.2实验部分

4.2.1原料与试剂

4.2.2主要仪器

4.2.3尼龙亲和膜的制备

4.2.4尼龙亲和膜的性质研究

4.2.5土豆汁中半胱氨酸蛋白酶抑制剂的纯化

4.2.6酶活的测定

4.3结果与讨论

4.3.1影响尼龙亲和膜制备的因素

4.3.2尼龙亲和膜的性质研究

4.3.3土豆汁中半胱氨酸蛋白酶抑制剂的纯化

4.4小结

参考文献

第五章总结及其展望

博士期间发表和投稿论文及专利申请

致谢