Development of Fluorescence Quantitative PCR method for Detection Dibutyl Phthalate

摘要

本课题研究目的旨在建立采用荧光定量PCR检测邻苯二甲酸二丁酯浓度的新方法。邻苯二甲酸二丁酯可以活化雌激素受体使之与包含特定序列的双链DNA结合，结合的DNA因受到保护可抵抗核酸外切酶ExoⅢ的消解而被保留，痕量的保留DNA可通过PCR扩增定量。根据该原理，首先从鲤鱼肝脏细胞中提取含雌激素受体的细胞溶质，再与不同浓度的邻苯二甲酸二丁酯结合使雌激素受体活化，形成配体-受体复合物。然后，以双链pUC19质粒DNA作为模板，设计合成特异性引物序列，通过普通PCR扩增制备双链结合DNA，使双链结合DNA与配体-受体复合物反应结合后，用核酸外切酶ExoⅢ和S1核酸酶消解，去除未受到保护的DNA。利用消解后产物作为模板，进行荧光定量PCR扩增反应，从而建立Ct值与邻苯二甲酸二丁酯浓度的标准曲线。同时探索最优反应条件，并确定荧光定量PCR的最低检测限及其结果的重复性。将该方法用于检测实际环境样品中邻苯二甲酸二丁酯的含量，并将检测结果同高效液相色谱法进行比较，比较两种检测方法的不同。
　　 实验结果表明，邻苯二甲酸二丁酯浓度在10-5g/L至10-10g/L之间时，邻苯二甲酸二丁酯浓度与Ct值线性关系显著。当邻苯二甲酸二丁酯浓度为10-10g/L时，结果呈正相关性。在该方法中，邻苯二甲酸二丁酯的检测下限是8.439pg/L。将荧光定量PCR技术用于检测水和土壤样品中的邻苯二甲酸二丁酯浓度，其检测结果分别为0.1058μg/L和0.1357ug/g。
　　 同时在高效液相色谱法与荧光定量PCR方法检测邻苯二甲酸二丁酯的比较中，发现荧光定量PCR具有反应灵敏、检出限低、重现性好、操作简便，可同时处理大批量样品等优点。因此荧光定量PCR可作为一种有效的痕量邻苯二甲酸二丁酯定量检测方法。