人核受体nr5a2(hb1f)转基因小鼠的建立及其分析

摘要

论文第一部分,将含人hb1fcDNA的质粒pcDNA3-hb1f显微注射入653颗小鼠受精卵的雄原核并回输至24只假孕受体母鼠输卵管,其中13只怀孕并产下97只仔鼠(雌性45,雄性52).经PCR法鉴定,共获得11只阳性候选Founder鼠,PCR阳性率为11.3％.进一步对PCR阳性的小鼠基因组DNA作Southern blot杂交鉴定,其中7只呈阳性,阳性率为7.2％.以PCR和Southern blot双阳性的hb1f转基因小鼠为Founder鼠,分别将其与正常C57小鼠杂交以建立转基因小鼠品系(命名为TGM-1、TGM-2、TGM-3、TGM-4、TGM-5、TGM-6和TGM-7).F1和F2代的PCR鉴定结果表明,7个Founder鼠的转基因都可稳定遗传给后代;其中品系TGM-1的4只F2(2♂2♀)经测交实验证实为转基因纯合子,已完成建系任务.同时,经RT-PCR和Western blot分析,发现除了TGM-2外其余6个hb1f转基因小鼠品系的肝脏都有NR5A2的表达;对TGM-1的转基因多组织表达分析表明,在CMV启动子驱动下,hb1f转基因可在肝脏、心、肺、胃和肾等部位表达.论文第二部分,为了解外源转基因的表达是否会造成转基因小鼠各重要脏器质性改变,TGM-1的主要组织器官经10％甲醛固定后者常规病理分析.最后,由于NR5A2在人肝组织有高表达,为在小鼠体内模拟这一现象,并避免外源转基因在肝外组织表达对结果分析带来的干扰,我们将hb1fcDNA置于小鼠白蛋白启动子/增强子序列下游构建肝特异表达的pA1b-hb1f载体;再通过原核显微注射将线性化的该载体导入631颗小鼠受精卵并回输至25只假孕母鼠输卵管以构建hb1f肝特异表达转基因小鼠模型.18只怀孕母鼠共产下114只仔鼠,经PCR鉴定获得4只携有pA1b-hb1f转基因的候选Founder鼠,阳性率3.5％;其中一只同时也为Southern blot阳性,阳性率为0.88％.考虑可能是二者敏感性差别造成检出率不一,所有4只均已作为候选Founder用于转基因小鼠品系的建立(命名TGM-A1、TGM-A2、TGM-A3和TGM-A4).该论文已完成人核受体NR5A2基因nr5a2(hb1f)的广谱和肝特异表达两个转基因小鼠模型建立,该模型的获得为在整体水平进一步深入揭示NR5A2的生理功能奠定了基础.此外,对nr5a2转基因小鼠的初步分析提示,NR5A2可能通过直接或间接但目前尚未知的机制下调焦磷酸法呢酯酯合成酶基因的表达,从而在胆固醇代谢平衡等过程中起调控作用.

目录

缩写词表

前 言

第一部分人核受体nr5a2(hblf)广谱表达转基因小鼠的建立

摘 要

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分人核受体nr5a2(hblf)广谱表达转基因小鼠的表型及肝脏基因表达谱改变分析

摘 要

实验材料

实验方法

结 果

1.转基因小鼠各组织形态学分析

2.转基因组织表达的免疫组化分析

3.转基因小鼠组织基因表达谱改变分析

4.肝脏Cbg和Fpps基因表达改变的半定量RT-PCR验证

讨 论

参考文献

第三部分人核受体nr5a2(hblf)肝特异表达转基因小鼠的建立

摘 要

实验材料

实验方法

结 果

讨 论

参考文献

研究工作小结

核受体研究进展综述

一、概述（Introduction）

二、核受体与脂生物学（Nuclear receptor and lopid physiology）

三、核受体与肿瘤（Nuclear receptor and tumor）

四、核受体与辅调节因子（Nuclear receptor and coregulator）

五、结语

参考文献

博士在读期间发表文章

致 谢