转录因子Gli1在乳腺癌细胞从雌激素依赖性向非依赖性转化中的作用及机制

摘要

乳腺癌是雌激素依赖性的肿瘤，雌激素可通过雌激素受体-α (EstrogenReceptor-α，ERα)的介导促进乳腺癌细胞的增殖。阻断雌激素对乳腺癌细胞的促增殖作用的内分泌治疗包括使用ER拮抗剂等药物能够抑制肿瘤细胞增殖，并诱导其凋亡。而乳腺癌细胞从雌激素依赖性生长转化为非依赖性生长是内分泌治疗失败，患者死亡的重要原因。但其发生机制尚不十分清楚。 Hedgehog(Hh)/Gli信号通路在胚胎发育中起着极其重要的作用，该通路的异常可造成多种先天畸形。越来越多的研究也表明Hh/Gli信号通路的异常激活会引起包括前列腺、胰腺、皮肤、小脑和消化道等多种肿瘤的发生发展。Hh信号通路是通过分泌蛋白Hh与细胞膜上的受体Patch1蛋白结合后，解除Patch1对另一膜蛋白Smoothed(Smo)的抑制，进而激活细胞内的信号转导通路，调控转录因子Gli蛋白家族的表达和活性，使得信号最终通过对靶基因的组织细胞的特异性转录而实现。Hh信号通路的异常激活引起的肿瘤，都存在有Gli转录因子的高水平表达。但关于Gli蛋白本身在肿瘤中的作用及其以何种机制参与肿瘤的发生发展的研究尚处于初步研究阶段。 Gli蛋白是Hh信号通路的最下游的转录因子，其家族在脊椎动物中由Gli1、Gli2和Gli3这3种蛋白组成，均可定位于胞质和胞核，DNA结合域由五个锌指蛋白结构所构成。Gli1蛋白直接就是转录激活子，而其本身又仅是Gli家族的靶基因，因而Gli1的mRNA的表达即是Hh/Gli信号通路激活的一个标志。在小鼠体内诱导过表达Gli1均可产生基底细胞癌样(basalcell carcinoma，BCC)病变。Gli1在许多人类成神经管细胞瘤、前列腺癌等中高表达。Gli1的表达可使低转移性的前腺癌细胞株转化成高转移性的细胞，表明Gli1可调控肿瘤细胞的转移。使用Gli1的siRNA(小片段干扰RNA)阻断人原代前列腺癌细胞中的Gli1的表达可抑制细胞的增殖已知Hh/Gli通路参与了乳腺的正常发育，近期有数篇文献报道了乳腺癌组织和细胞中Hh/Gli通路中通路成员的表达情况，结果显示在60％以上的癌组织中有Gli1等成员的表达增多，在部分乳腺癌细胞株中用环杷明(cyclopamine)阻断阻断该信号通路的活性，不仅可抑制Gli1表达，而且还可以抑制细胞的增殖。目前尚不清楚Gli1本身对乳腺癌细胞增殖的直接作用，亦没有发现Gli1在乳腺癌细胞向雌激素非依赖性生长转化中作用方面的研究报道。 为研究Gli1本身对乳腺癌细胞增殖和进展的影响，我们首先观察了在4株乳腺癌细胞中Patch1(Hh的受体)和Gli1的表达情况，结果显示Gli1的表达水平在雌激素非依赖性乳腺癌细胞(MDA-MB-231和MDAMB-435)中远高于雌激素依赖性乳腺癌细胞(MCF-7和T47D)，并且二者的表达水平与ER的表达呈负相关。在此基础上，我们作了以下工作： 1．建立了稳转Gli1表达载体的MCF-7细胞系，并用实时定量RT-PCR(Quantitative Real-time PCR，QRT)的方法从中筛选了两个高表达Gli1的细胞克隆，其中Gli1-clonel和Gli1-clone2的Gli1的表达水平分别为空载对照细胞(稳转了空载体pcDNA3.1的细胞)的12和6倍。 2．用流式细胞仪检测细胞周期观察了在没有雌激素刺激的条件下，Gli1的持续性过表达对细胞增殖的影响。结果发现Gli1-MCF-7细胞的G1期减少，S期增多，细胞周期进程明显加快。其中Gli1-clonel和Gli1-clone2的S期细胞的比例分别为与空载对照细胞的2.3和1.7倍，表明Gli1的高表达能明显促进乳腺癌细胞雌激素非依赖性增殖。 3．MCF-7细胞是雌激素依赖性细胞系，我们进一步观察了在ER激动剂或ER拮抗剂处理下，Gli1过表达对细胞增殖和成瘤的影响。实验显示，空载体对照细胞对雌激素类试剂的处理有很高的反应性，ER激动剂能明显促进其增殖，而ER拮抗剂能明显抑制其增殖；而Gli1高表达的细胞对ER激动剂的增殖促进和对ER拮抗剂的增殖抑制的反应性明显减弱。裸鼠实验中，在补充雌激素条件下，与对照细胞相比，Gli1-clonel细胞在裸鼠中形成的移植瘤体积明显增大。当裸鼠移植瘤长到160mm<'3>时，停止补充雌激素，给予他莫西芬(TAM)或豆油(空载对照)皮下注射，之后对照细胞pcDNA3.1-MCF-7的移植瘤体积逐渐缩小，而Gli1-clone1移植瘤体积继续增大，表明Gli1还可降低乳腺癌细胞对内分泌治疗的反应性。以上结果说明Gli1可能参与了乳腺癌细胞从雌激素依赖性生长向雌激素非依赖性生长的转化和乳腺癌细胞对内分泌治疗抵抗的发生。 4．在探讨Gli1减弱MCF-7细胞对ER激动剂和拮抗剂生长反应性的机制中，我们发现Gli1持续性高表达的MCF-7细胞克隆中ERα和PR的表达与对照细胞相比，分别降低了约50％和70％；用报告基因方法发现瞬转的Gli1可将ERα的转录活性降低约50％，我们还发现瞬转Gli1可以使细胞NF-κB的转录活性升高。 5．我们的实验还表明MCF-7细胞中ERα的过表达能促进Gli1的表达和转录活性，表明在乳腺癌细胞中存在Gli1和ERα的相互作用。 以上结果表明Gli1表达增多可以明显促进乳腺癌细胞雌激素非依赖性的增殖，并减弱乳腺癌细胞对ER激动剂和拮抗剂生长反应性，提示Gli1在乳腺癌向雌激素非依赖性生长转化和在肿瘤对内分泌治疗的抵抗中具有重要作用。Gli1的上述作用可能与其降低ERα和PR表达、抑制ERα的转录活性有关，Gli1诱导的NF-κB的活性的增高可能也参与了这个过程。同时ERα可促进Gli1的表达和活性，表明在乳腺癌细胞中存在Gli1和ERα的相互作用，提示在乳腺癌的发展过程中，Gli1可能逐渐取代ERα在乳腺癌细胞中的促增殖作用，使乳腺癌细胞从雌激素依赖性生长向非依赖性生长转化。

目录

论文说明：英文缩写词

声明

前言

材料和方法

结果

第一部分Gli1对乳腺癌细胞雌激素依赖性和非依赖性增殖的影响及其机制

第二部分ERα在乳腺癌细胞中对Gli1表达和转录活性的影响

讨论

小结

参考文献

综述：Hedgehog/Gli信号通路与肿瘤

附录

致谢