循环心肌肌钙蛋白Ⅰ自身抗体检测及对常用肌钙蛋白Ⅰ检测系统负性干扰评估

摘要

人心肌肌钙蛋白(Cardiac Troponin)是心肌调节蛋白,其亚单位心肌肌钙蛋白I(cTnl)是具有210个氨基酸的多肽,相对分子量为24KD,仅存在于心房肌和心室肌。因cTnl的氨基端较骨骼肌TnI多31个氨基酸,两者氨基酸序列的差异达40％,故具有较好的心肌特异性。心肌发生损伤时,释放到人体血液循环中的cTnI既有游离形式,又有不同复合物的形式,包括cTnl-C、cTnI-T以及cTnI-ToC等,现已证实在人体循环的cTnI中90％以上为cTnI-C二聚体复合物形式稳定存在。 cTnI在心肌损伤时释放入血,是心肌损伤敏感而特异的标志物,对于诊断急性冠状动脉综合症患者(ACS)心肌缺血及危险分级具有重要意义。自1987年Cummins等报道以血清cTnI对心肌梗死进行诊断以来,cTnI已逐渐取代肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)等心肌酶学指标,成为诊断心肌梗死的首要血清标志物,cTnI也是独立于心电图(ECG)之外可用于判断心肌梗死灶范围大小及预后的重要血清学指标。同时,cTnI也用于评判不稳定型心绞痛患者罹患心肌梗死和心源性死亡的危险率,亦是判断冠心病患者是否应接受抗凝药物,如血小板糖蛋白II b/Ⅲa受体拮抗剂治疗的唯一标志物。近年来,cTnI已开始为诊断病毒性心肌炎及判断药物、大手术创伤等所致心肌受损的诊断和严重程度等提供帮助。 cTnI检测多采用双抗体夹心法。最初检测cTnI的捕获抗体和标记抗体多为多克隆抗体,存在一定的交叉反应,敏感性较差。随着cTnI单克隆抗体的使用和检测系统的不断优化,cTnI测定的敏感性和特异性大大提高,目前在国内外被有关机构批准用于临床cTnI测定的检测系统已达十余种。cTnI多肽链的大部分序列均具有抗原性,但其氨基末端和羧基末端的抗原性最强,从理论上讲,cTnI检测系统中的检测抗体若针对上述区域抗原表位,将会达到最好的检测效果。然而,cTnI分子的氨基末端和羧基末端很容易受到蛋白水解酶水解而降解,无疑会直接影响测定结果。在cTnI肽链中心区域(第30～110位氨基酸残基)因受到TnC亚基的保护,稳定性明显提高。因此选用针对cTnI肽链中心区域的抗体组成的检测系统,可以较好地消除cTnI分子降解而对结果造成的影响。2007年国际临床化学学会最新发布的急性冠脉综合征和心力衰竭的临床实验室诊断指导原则指出,cTnI试剂生产厂家应优先选择针对cTnI中心稳定区域的抗体作为检测抗体。然而进一步的研究揭示,即使是选择针对cTnI中心稳定区域的捕获抗体和检测抗体而建立的检测系统,也会受到多种干扰因素的影响使cTnI检测值假性升高或降低。由于cTnI在正常人血循环中浓度非常低,故cTnI检测系统的临床临界值也比较低,其假阴性或者假阳性干扰很容易误导临床诊断。鉴于cTnI检测在诊断心肌损伤中的重要作用和对于治疗的重要指导作用,充分认识cTnI检测中的任何干扰都是十分必要的。研究发现,除了在免疫学测定中常见的异嗜性抗体、类风湿因子、纤维蛋白原、黄疸、血红蛋白、抗凝剂等干扰因素外,cTnI自身抗体引起的负性干扰尤为严重。在生理状态下,cTnl为隔绝免疫系统的隐蔽抗原,在某些病理条件下,由于心肌细胞的损伤和破坏导致cTnI释放入血,引发机体免疫系统产生cTnI自身抗体。1996年Bohner等首次报道了cTnI检测中cTnI自身抗体引起的负性干扰现象,随后研究发现cTnI自身抗体恰好特异性封闭cTnI的第30～110位中心稳定氨基酸残基区域的抗体结合位点,影响了检测抗体与循环中cTnI结合而导致其测定值假性降低。2005年Eriksson等采用回收试验等方法,初步发现约有3.2％的胸痛患者可能因为受到cTnI自身抗体的负性干扰使其血清cTnI检测的回收率小于10％。既然血清中cTnI自身抗体对cTnI的检测可以造成如此大的影响,但急性心肌梗死(AMI)或心肌炎等心肌损伤患者血清中cTnI自身抗体阳性率到底是多少?cTnI自身抗体滴度与cTnI测定负性干扰严重程度是否相关?其对当前各个cTnI检测系统中的干扰程度究竟如何?本课题旨在给这些疑问寻找答案。本研究结果对cTnI检测和结果的临床应用具有一定的指导意义,同时也为cTnI检测试剂盒的研发和改善提供侧重点。 第一部分：人心肌肌钙蛋白I-C(cTnI-C)融合蛋白在大肠杆菌系统中的可溶性表达及纯化 本部分实验目的是为建立筛查cTnI自身抗体的EIJSA方法制备包被抗原。根据心肌损伤患者血清中cTnI主要以cTnI-C复合物形式存在,且与TnC形成复合物后稳定性增加,不易被蛋白酶水解的特点,构建cTnI和TnC融合蛋白原核表达载体。采用硫氰酸胍-酚氯仿一步法提取(TRIzol试剂,美国GIBCO BRL公司)人心肌组织总RNA,进行逆转录反应合成cDNA。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR,日本TaKaRa公司RT-PCR试剂盒)扩增包含cTnI和TnC开放阅读框的650bp和500bp序列,中间用19个中性氨基酸为主的短肽将cTnI和TnC连接到一起,构建全长cTnI-C融合蛋白的pET28原核表达系统,在大肠杆菌中进行可溶性表达。目的蛋白氨基端带有组氨酸“标签”(His-tag),采用Ni2+金属螯合亲和层析纯化。纯化产物鉴定结果:纯化产物经12％十二烷基磺酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示在相对分子量为43KD附近有清晰目的蛋白表达条带,灰度扫描目的蛋白纯度为86.9％。进一步使用鼠cTnI单抗(长海医院实验诊断科惠赠)进行蛋白质印迹分析(Western Blot),在相对分子量为43KD附近显示单一印迹,无降解条带。融合蛋白于-80℃冰箱分装冻存,实验过程中采用Access-2(美国Backman Coulter公司)微粒子化学发光免疫分析仪及AccuTnI试剂盒监测cTnI浓度,cTnI-C融合蛋白稳定无降解。 第二部分:建立检测人cTnI自身抗体的间接ELISA方法 本部分实验以第一部分实验中重组表达的cTnI-C融合蛋白包被96孔聚苯乙烯板,以鼠抗人cTnI单克隆抗体为一抗确定cTnI-C融合蛋白的包被浓度,初步建立检测cTnI抗体的间接ELIA方法。使用该方法对长海医院80名AMI患者血清进行盲筛,从中选出一份在450nm波长时吸光度(A450nm)最高的血清,该血清经Western Blot鉴定,可与cTnI-C融合蛋白聚丙烯凝胶电泳(PAGE)后转移至硝酸纤维素膜上相对分子量为43KD的目的蛋白特异结合,将此血清确定为阳性血清。收集长海医院210名健康体检者血清,做为阴性血清,进一步优化检测cTnI自身抗体的间接ELISA法。 通过棋盘滴定实验,检测cTnI自身抗体的间接ELISA法的最佳工作条件为:包被抗原浓度为10μg/L,血清稀释度为1:50,酶标二抗(辣根过氧化物酶HRP标记羊抗人IgG,美国KPL公司)稀释度为1:8000。阳性血清在450nm处的吸光度(A450nm)均值为1.52。210份阴性血清的A450nm为0.19,SD为0.12,阳性临界值设定为阴性均值A450nm+3SD,即0.55。 第三部分:AMI和心肌炎患者中cTnI自身抗体阳性率的筛查和确认收集长海医院心内科121名AMI患者血清(既往诊断为冠心病、心绞痛的63名,陈旧性心梗的47名；有心脏手术史的21名)、24名心肌炎患者(有心肌炎病史的13名,否认有心肌炎病史的11名)血清和210名年龄、性别相匹配的健康体检者血清,采用第二部分实验中所建立的检测cTnI自身抗体的间接ELISA方法进行cTnI自身抗体的筛查。ELISA检测阳性的血清进一步采用Western Blot进行确证。对ELISA和Western Blot检测均为阳性的血清,取其中1份加入不同浓度的cTnI-C融合蛋白,在Access-2上进行cTnI剂量依赖实验,验证cTnI与cTnI自身抗体的结合特异性。 第四部分:cTnI自身抗体对常用cTnI检测系统负性干扰评估 在确证为cTnI自身抗体阳性的13份AMI患者血清中加入cTnI终浓度为20μg/L的重组cTnI-C融合蛋白,在上海市5个主要的cTnI检测系统上进行回收试验(2名cTnI自身抗体阳性的心肌炎患者分别是3岁和4岁,未能采集足够的血清进行本部分实验)。5家cTnI检测系统分别为:Access-2(Backman Coulter),临床诊断值0.1μg/L;Vidas(Biomerieux),临床诊断值0.1μg/L;Architect i2000(Abbott),临床诊断值0.3μg/L;Axsym(Abbott),临床诊断值2.3μg/L;Dimension X Pand(Dade Behring),临床诊断值0.15μg/L。设回收率0～50％为低回收率,50～80％为中等回收率,>80％为正常回收率。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

前言

第一部分：人心肌肌钙蛋白I-C融合蛋白在大肠杆菌表达系统中的可溶性表达及纯化

一、实验装置与方法

二、实验结果

三、分析与讨论

第二部分：检测抗人心肌肌钙蛋白Ⅰ自身抗体ELISA方法的建立

一、实验装置与方法

二、实验结果

三、分析与讨论

第三部分：AMI和心肌炎患者中cTnI自身抗体阳性率的筛查和确认

一、实验装置与方法

二、实验结果

三、分析与讨论

第四部分：循环cTnI自身抗体对各常用cTnI检测系统负性干扰评估

一、实验装置与方法

二、实验结果

三、分析与讨论

附录

综述：内源性自身抗体对免疫检测的干扰分析

参考文献

在读期间发表论文情况

致谢