中药单体化合物Lariciresinol对树突状细胞功能的调控作用及其机制研究

摘要

免疫抑制剂具有重要的临床应用价值，广泛应用于器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗，常见的免疫抑制剂有糖皮质激素、维生素D3、环孢素A、雷帕霉素、它克莫司等。这些免疫抑制剂在临床应用的过程中，在产生治疗效应的同时，也具有一定的副作用，因此，研发新的具有治疗作用的免疫抑制剂意义重大。作为我国传统医学中的瑰宝，中草药对疾病的预防和治疗作用，尤其是对炎症、感染、肿瘤、自身免疫、移植排斥等疾病的预防和治疗作用，主要是通过免疫系统实现的。中药中很可能存在具有免疫抑制作用的成分，发现这些成分并研究其功能具有理论和应用价值。由于树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是机体免疫应答中的关键细胞，该类细胞也很可能是免疫抑制剂的主要的靶细胞，因此，以DCs作为靶细胞很可能筛选到具有抑制作用的中药成分。鉴于此，我们课题组与第二军医大学药学院张卫东教授课题组合作，利用基于DCs分化发育和功能成熟的药物筛选平台，从496种中药单体化合物中成功筛选出18类31个有效单体成分。并选择对DCs分化发育抑制率较高，而本身的细胞毒性较小，且能有效促进DCs分泌IL-10的免疫抑制性的丝毛瑞香的提取物Lariciresinol(分子式C20H21O6)作为研究对象，深入研究该成分对DCs的调控及其机制；并使用过敏性自身免疫反应性脑脊髓膜炎(EAE)模型研究了其在体内应用的有效性。
　　 (一)中药单体化合物Lariciresinol对DCs功能的影响
　　 以本身的细胞毒性较小，且能有效促进DCs分泌IL-10的Lariciresinol成分为研究对象，研究了Lariciresinol对DCs的凋亡诱导作用、对DCs吞噬功能、成熟表型、细胞因子分泌、激发同种异体免疫反应和抗原提呈能力的影响。我们以GM-CSF和IL-4诱导小鼠骨髓细胞生成DCs，并使用药物处理第五天的未成熟DCs24小时，再用终浓度为100ng/ml的LPS刺激24小时，检测相应指标。使用FACS检测annexin V和PI的方法确定了16nmol/ml为Lariciresinol对未成熟DCs的无毒性浓度范围。后期的研究发现，Lariciresinol不能影响DCs的吞噬和分泌IL-12P70、TNF-α和TGF-β的能力，却能明显促进抑制性细胞因子IL-10的分泌，并能抑制DCs激发同种异体免疫反应(MLR)和特异性抗原提呈能力。
　　 (二)中药单体化合物Lariciresinol促进DCs分泌IL-10的机制研究
　　 IL-10是一种重要的具有免疫负调节作用的细胞因子。Lariciresinol是如何促进IL-10分泌的呢?进一步实验发现，Lariciresinol对DCs分泌IL-10的促进具有Lariciresinol浓度梯度依赖性和LPS的浓度梯度依赖性。那么，促进的信号通路如何呢?我们采用Western Blot技术，Lariciresinol处理第五天的未成熟DCs24小时，再加入终浓度为100ng/ml的LPS，并在第0、15、30和60分钟，裂解细胞，收集蛋白检测ERK1/2、p38和JNK的磷酸化情况，发现Lariciresinol能够明显增强ERK1/2的磷酸化；ERK1/2信号通路抑制剂PD98059能够抑制Lariciresinol对DCs的IL-10分泌促进作用，另外，p38信号通路抑制剂SB203580，亦能抑制Lariciresinol促进的IL-10分泌作用。由此，证明了Lariciresinol通过ERK1/2信号通路促进DCsIL-10的分泌，而对P38信号可能具有基础性的活化作用。
　　 (三)中药单体化合物Lariciresinol处理的DCs过继转移和Lariciresinol体内注射均能抑制自身免疫病的发生
　　 既然，Lariciresinol可以明显促进DCs分泌IL-10的能力，并能部分抑制DCs的成熟和抗原提呈能力，那么，Lariciresinol处理的DCs能否通过诱导免疫耐受而抑制自身免疫病的发生呢?Lariciresinol直接体内注射，又如何呢?本部分研究中，我们通过小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型，对其抑制作用进行了研究。
　　 以MOG35-55多肽作为抗原，辅以腹腔注射百日咳毒素，成功地建立C57BL/6小鼠的EAE模型。其中抗原肽诱导建立的EAE组小鼠发病率达到95％，平均临床打分为3.16±0.79，并且该EAE模型为复发-缓解型，在疾病过程中具有间歇期和不同程度的恢复。随后我们观察了Lariciresinol处理的DCs对EAE诱导的保护效果。取培养至第五天的骨髓细胞来源的未成熟树突状细胞，8nmol/ml Lariciresinol处理24小时，用LPS刺激活化18小时后负载髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG35-55抗原肽，通过腹腔注射免疫正常C57BL/6小鼠，免疫后第二天在各组小鼠中诱导EAE。我们发现与对照组小鼠相比，Lariciresinol处理的DCs组小鼠的发病时间明显推迟；发病率也明显下降；此外，与对照组比较，临床神经功能评分也有所改善。以上结果都显示，Lariciresinol处理的DCs能使EAE诱导的发病时间推迟，降低小鼠的发病几率，改善小鼠的临床症状，对MOG35-55抗原肽诱导的EAE具有保护作用。为了进一步从体内验证Lariciresinol的直接作用，我们腹腔内直接注射Lariciresinol一周后，直接诱导EAE发病，结果发现Lariciresinol直接注射对EAE的抑制作用更明显。
　　 综上所述，我们对Lariciresinol对DCs免疫功能的调节及其机制进行了研究。发现Lariciresinol通过ERKI/2和P38 MAPK信号途径促进LPS刺激的DCs的IL-10分泌。Lariciresinol处理的DCs过继转移及Lariciresinol直接体内注射都具有一定的免疫抑制功能。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前 言

第一部分 中药单体化合物Lariciresinol对树突状细胞功能的影响

一、材料和方法

二、结果

三、讨论

第二部分 中药单体化合物Lariciresinol促进树突状细胞分泌IL-10的机制研究

一、材料和方法

二、结果

三.讨论

第三部分 中药单体化合物Lariciresinol对自身免疫病的抑制作用研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

小结

参考文献

靶向DCs的自身免疫病免疫治疗研究进展(文献综述)

致谢