可卡因-苯丙胺调节转录肽人源化单链抗体的构建，表达，纯化及生物学作用

摘要

可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine-and amphetanmle-regulaied transcript,CART)是一种在体内广泛分布并具有多种生理功能的神经肽，除参与摄食行为，应激反应，体液平衡，内分泌，药物奖赏等功能的调节外，还与药物依赖密切相关。研究表明急性注射可卡因可导致大鼠纹状体内CART mRNA水平急剧增高。
　　 研究目的：对构建成功的可卡因-苯丙胺调节转录肽单链抗体进行人源化改造以降低其免疫反应性，蛋白表达与纯化人源化单链抗体(hScFV)，观察其对急性可卡因诱导的自发活动增强、慢性可卡因诱导的行为敏化和条件性位置偏爱的影响。
　　 研究方法：PCR技术扩增人单链抗体VH、VL及鼠CART-ScFV抗原结合部位的DNA片段；连接并定向克隆到原核表达载体pET-15b；诱导表达CART-hScFV蛋白，利用Nisepharose High Performance亲和层析技术纯化抗体蛋白；ELISA方法检测抗体亲和力；行为学方法(自发活动，条件性位置偏爱)检测抗体生物学活性。
　　 结果：成功构建了61个PET-15b-CART-hScFV原核表达质粒，分别是AHl,AH4,AH6，AH19,AH33和AH36。其中，除AH6外，均可在E.coli以包涵体形式表达。成功纯化5个CART-hScFV，蛋白纯度>90％。ELISA检测所纯化抗体发现具有较好的亲和力，选取AH33和AH36(抗体效价分别为O.17μg/ml,0.04672μg/ml)进行行为学实验。AH33(O.04mg/kg,O.2mg/kg,1mg/kg)和AH36(0.2mg/kg,1mg/kg,5mg/kg)均可对可卡因诱导的小鼠自发活动增强和慢性可卡因诱导的小鼠行为敏化产生不同程度的抑制效应。在敏化模型建立的转化期连续给予CART-hScFV能够有效抑制小鼠行为敏化的转化。在可卡因诱导的小鼠条件性位置偏爱实验中，AH33的中等剂量组(0.2mg/kg)和AH36的中高剂量组(1mg/kg,5mg/kg)均能明显改变小鼠的条件性位置偏爱表达。但是，AH33和AH36都不能阻止CPP的点燃重建。
　　 结论：原核表达技术可大量表达具有生物学活性的CART肽人源化单链抗体；单次腹腔注射CART-hScFV-AH33和CART-hScFV-AH36可有效抑制可卡因诱导的小鼠自发活动的增强和行为敏化的表达；在行为敏化形成的转化期连续预防性给予CART-hScFV-AH33和CART-hScFV-AH36均能够抑制小鼠行为敏化的转化过程；单次治疗性腹腔注射CART-hScFV-AH33和CART-hScFV-AH36可改变可卡因诱导的小鼠条件性位置偏爱(CPP)，但不能有效抑制小鼠条件性位置偏爱的点燃重建。提示，CART-hScFV-AH33/AH36在治疗药物成瘾上具有一定潜力。

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论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分 可卡因-苯丙胺调节转录肽人源化单链抗体制备

第二部分(Ⅰ) 行为学实验Ⅰ-CART hScFv对小鼠行为敏化的影响

第二部分(Ⅱ) 行为学实验Ⅱ-CART hScFv对小鼠条件性位置偏爱的影响

结论

Reference

综述 CART 肽及其功能

致谢