临床微生物样本中持留菌的筛选及对肺炎克雷伯杆菌持留株持留机制的研究

摘要

背景：抗生素在杀菌抗感染方面为人类带来了巨大贡献，但随之而来的耐药问题，给全球抗感染治疗带来极大挑战。目前，随着细菌耐药机制研究的越发深入，研究者越来越关注一种特殊的耐药情况，即病原体表型耐药，其耐药机制不涉及细菌基因组突变，但在高浓度抗生素作用条件下，仍有一小部分细菌存活，抗生素压力撤销后，这部分细菌又恢复增殖生长。其实，这一现象在抗生素应用早期即已发现，1944年，Joseph Bigger在研究盘尼西林药效动力学时，首先描述了持留菌(persister)和细菌持留(Bacterial persistence)现象，其发现，向处于生长期的金黄色葡萄球菌菌液中加入盘尼西林，有一小部分细菌仍能存活，但这些细菌并不是耐抗生素的突变株。Bigger推测，持留菌能躲避抗生素杀伤，是由于这些细菌处于休眠状态，细胞整体代谢水平下调，且不进行分裂生长，因此能躲避抗生素杀伤。由于持留菌在细菌种群里比例极低，且分离鉴定持留菌较困难，关于它的研究停滞了相当长的时间，直到上世纪80年代，对持留菌的分离培养才取得些许进展，目前各国科学家已成功分离培养出了大肠杆菌、结核杆菌、金黄色葡萄球菌、纳豆芽孢杆菌等细菌的持留变异株，在真菌方面，也有研究报道了白色念珠菌的持留现象，这些发现大大推动了对该领域的研究。在持留机制方面，生物被膜、毒素-抗毒素组件等已被确定与持留相关，但是微生物持留过程复杂，不同菌种的持留特性不同，且目前已知的机制并不能解释所有的持留现象;特别是在慢性感染、抗生素失效、临床耐药现象越来越突出的情况下，迫切需要重新面对这个老问题，开展新的研究。
　　目的：研究从临床微生物样本库出发，筛选持留菌样本，并分析其临床分布特点;对持留菌进行持留特性研究，明确持留特性与感染时间及抗生素用药之间的关系;用转座子诱导突变法，确定肺炎克雷伯杆菌持留株的持留相关基因，为后续持留相关基因的表达调控研究、建立持留菌分离鉴定方法等提供研究基础。
　　方法：
　　1.对临床微生物样本进行数据分析，将临床分离率最高的4种细菌定为研究对象，用活菌平板计数法确定菌液浓度，绘制每个临床样本在抗生素作用条件下的生长曲线图，根据曲线特点，判断其是否为持留菌。
　　2.根据抗生素作用3小时后的存活率，判断细菌样本的持留水平，研究持留菌对抗生素浓度、抗生素类型的耐受程度;追溯持留菌感染患者病历，研究持留水平与抗生素用药及感染时间之间的关系。
　　3.用功能定位法确定持留相关基因，研究对象为肺炎克雷伯杆菌持留株。首先用转座子诱导突变法建立诱导突变库，然后挑选出失去持留特性的突变株，对插入片段进行定位，确定持留相关基因。
　　结果：
　　1.对临床微生物样本库分析后确定，临床分离率最高的革兰阴性菌分别为大肠埃希菌(13.2％)、肺炎克雷伯杆菌(9.6％)、铜绿假单胞菌(8.0％)，革兰阳性菌中分离率最高的为金黄色葡萄球菌(6.6％)。对这4种细菌进行持留菌筛选，共得到41株持留菌，包括4株大肠杆菌持留株，23株肺炎克雷伯杆菌持留株，8株铜绿假单胞菌持留株，6株金黄色葡萄球菌持留株。
　　2.持留菌具有多重耐药性，随抗生素浓度升高，细菌持留存活率降低，持留菌对不同抗生素的持留水平不同，其中大肠埃细菌对头孢噻肟的持留水平最低，肺炎克雷伯杆菌对环丙沙星的持留水平最低，铜绿假单胞菌对左氧氟沙星的持留水平最低。持留菌感染患者有长期抗生素用药史，但没有发现细菌持留水平随感染时间延长而提高。
　　3.用转座子诱导突变法构建肺炎克雷伯杆菌持留株突变体库，共获得3282个突变株，并从中筛选到1株失去持留特性的突变株，通过反向PCR等方法确定持留基因为NC016845.1基因，该基因编码磷酯酶D，参与细菌磷脂代谢。
　　结论：对我院临床微生物样本进行回顾性分析，共获得41株持留株，持留菌的临床感染率仍较低，慢性感染大部分是由发生基因突变的耐药菌导致;持留菌对不同抗生素持留水平不同，持留菌感染患者有长期抗生素用药史，未发现细菌持留水平随感染时间延长而提高;基因NC_016845.1参与肺炎克雷伯杆菌的持留过程。我们推测，在面对宿主免疫系统清除、或抗生素杀伤时，磷脂酶D通过改变细胞膜成分及细胞膜表面电荷，影响细菌与宿主环境或抗生素的相互作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 临床样本中持留菌的筛选

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第二部分 持留菌持留特性研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

第三部分 肺炎克雷伯杆菌持留株持留机制研究

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

全文总结

参考文献

综述 持留菌，细菌休眠与感染性疾病的关系

攻读学位期间发表论文情况

致谢