胃泌素释放肽受体拮抗剂在小鼠肝缺血再灌注损伤中的保护作用

摘要

研究目的：
　　肝缺血再灌注(ischemia and reperfusion，I/R)损伤是肝移植，肝切除手术，创伤，失血性休克和心肺复苏等临床常见并发症，严重影响患者的预后。然而，肝I/R损伤的内在分子机制尚未完全明确，目前研究证据表明，当发生肝I/R损伤时，复杂的内在因素，例如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，趋化因子和炎性细胞因子，导致中性粒细胞浸润、炎症反应与肝细胞损伤。但目前用于防止肝I/R损伤的治疗策略并不是最优化的。
　　胃泌素释放肽(gastrin-releasing peptide，GRP)是一种活性神经肽，与其受体胃泌素释放肽受体(gastrin-releasing peptide receptor，GRPR)相互作用后可促进细胞生长，参与免疫功能调节等多种生物学功能，已有研究表明GRP-GRPR在脓毒症、胆囊炎等炎症性疾病中发挥重要作用，通过阻断GRP-GRPR反应可以抑制炎症发展，改善免疫功能失常状态。
　　那么，GRP-GRPR在小鼠肝I/R模型中发挥何种作用，阻断GRP与GRPR反应能否改善肝I/R损伤尚未见报道。因此，本研究拟建立部分肝缺血再灌注损伤小鼠模型，观察GRP和GRPR在小鼠肝脏中的表达情况;探索GRPR拮抗剂RC-3095对小鼠肝I/R损伤的保护作用，并探索其可能的作用机制。
　　研究方法：
　　1、将C57BL/6小鼠按照再灌注时间随机分为假手术组(sham，n=6)和I/R3h组(3h，n=6)、I/R6h组(6h，n=6)、I/R12h组(12h，n=6)、I/R24h组(24h，n=6)，I/R组小鼠建立70％肝组织I/R损伤模型，缺血时间均为60min; sham组小鼠仅剖腹探查，并不做肝门部血管结扎处理。在缺血60min，再灌注3h，6h，12h和24h不同时间点时，各组小鼠于七氟醚麻醉下心脏穿刺采血，并获取缺血部分肝脏组织，采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法测定小鼠血清和肝组织中GRP的表达水平;蛋白质免疫印记法(Western-blotting，WB)测定肝脏组织中GRPR蛋白的表达水平。
　　2、将C57BL/6小鼠随机分为三组:假手术组（sham，n=6）、I/R组(I/R，n=6)以及RC-3095组(RC-3095，n=6)。缺血60min时，RC-3095组小鼠予以皮下注射RC-3095(3 mg/kg，150μl)，sham组及I/R组小鼠皮下注射同等体积生理盐水。注射后进行再灌注，6h后，七氟烷麻醉下心脏穿刺采血处死，并获取各组小鼠缺血部分肝脏组织，①生化检测仪测定血清AST、ALT浓度;②H&E染色后评估肝组织形态学改变;③检测肝脏髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，评估肝组织氧化应激和中性粒细胞浸润程度;④ELISA检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10水平;⑤采用TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)法检测缺血肝细胞凋亡情况。
　　3、另取32只C57BL/6小鼠，分组情况同2，再灌注时间为6h，12h，24h，七氟烷麻醉下心脏穿刺采血处死小鼠后，肝组织经匀浆、蛋白定量后，WB法检测核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)活化和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminalkinase，JNK)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、p38-MAPK(mitogen-activated protein kinase，MAPK)磷酸化水平。
　　研究结果：
　　1、GRP和GRPR表达:肝脏缺血60min，再灌注3h，小鼠肝组织中GRP便升高且达到峰值，持续到再灌注后6h（P＜0.01），随后逐渐降低，但12h和24h时与sham组仍存在显著差异;血清中，GRP3h时也显著升高，6h达到峰值(P＜0.01)，随后开始下降，12h和24h时与sham组并无显著差异;肝组织GRPR在再灌注3h时表达上调，6h后也达到峰值（P＜0.05），随后开始降低，12h和24h表达与Sham组小鼠并无统计学差异。
　　2、RC-3095干预后，与I/R组相比较，RC-3095组小鼠肝损伤改变如下:血清AST、ALT显著降低(P＜0.01);H&E染色显示肝脏细胞肿胀减轻，炎症反应降低，中性粒细胞浸润减少(P＜0.01);TUNEL染色显示肝细胞凋亡明显减少(P＜0.01);MPO酶活性显著减弱(P＜0.01);血清和缺血肝脏组织中TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平下调(P＜0.01)，IL-10无改变，提示RC-3095改善了肝I/R后肝脏的损伤和炎症反应。
　　3、GRP-GRPR参与肝脏I/R损伤的机制探讨显示:RC-3095组小鼠肝脏NF-κB活性比I/R组减弱，并JNK、ERK、p38磷酸化水平降低(P＜0.01）。
　　研究结论：
　　1、GRP-GRPR在小鼠肝I/R损伤中显著上调;
　　2、GRPR拮抗剂RC-3095显著抑制肝I/R后的炎症反应和肝细胞坏死，从而改善肝损伤;
　　3、GRPR拮抗剂RC-3095抑制小鼠肝I/R损伤后的NF-κB活性，并抑制JNK、ERK、p38-MAPK磷酸化，提示GRP可能通过NF-κB和p38/JNK/ERK通路调节肝I/R损伤的炎症反应。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照表

前言

材料与方法

一、实验材料

二、研究方法

三、统计学分析

结果

一、小鼠肝I／R后血清和肝组织中GRP的表达

二、小鼠肝I／R后肝组织中GRPR的活化

三、RC-3095对小鼠肝I／R后ALT／AST水平的影响

四、RC-3095对肝I／R小鼠肝脏病理的影响

五、RC-3095对肝I／R小鼠肝细胞凋亡的影响

六、RC-3095对肝I／R小鼠肝组织中性粒细胞浸润的影响

七、RC-3095对肝I／R小鼠肝组织MPO活性的影响

八、RC-3095对肝I／R小鼠外周血和肝组织中细胞因子表达的影响

九、RC-3095对肝I／R小鼠肝组织MAPK(JNK，ERK，p38)磷酸化水平和NF-κB活化的影响

讨论

全文总结

参考文献

文献综述 胃泌素释放肽在炎性疾病中的作用

发表论文和参与科研工作情况

致谢