肝外胆管系统中CD63+干细胞的识别鉴定及其修复肝脏损伤能力的研究

摘要

肝脏干细胞是一类具有自我更新能力并可分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞的肝脏原始细胞，它们参与肝脏发育、生长和损伤修复与再生的过程。在前期的研究中，我们发现肝干细胞作为细胞移植的治疗用细胞与成熟肝细胞等其它类型细胞相比至少有以下优点:1）肝脏干细胞植入受体后增殖能力强并有重构肝干细胞巢的潜能;2）肝干细胞可以分化为肝细胞、胆管上皮细胞和其他间质细胞;3）体外对肝干细胞的培养和扩增比成熟肝细胞相对容易;4）肝干细胞为原始未分化状态细胞，相对于其他细胞，免疫原性很低。因此，我们认为肝干细胞很可能是理想的肝脏疾病治疗用细胞的来源。然而，现有的研究已经知道存在于肝脏内的干细胞的数量极少，再加上正常肝脏组织的来源很不容易，所以在基于肝干细胞肝脏疾病治疗中多元的治疗用细胞来源则是一个值得解决的问题。鉴于肝内和肝外胆管在发育上、功能上和空间上的连续性，以及其它实验室关于肝外胆管中有干性细胞存在的报道，我们意识到了利用肝外胆管组织来解决肝脏疾病治疗用干细胞来源匮乏的可能性。基于这一考虑，本研究希望回答两个基本的生物学问题:1）肝外胆管中的什么细胞是真正的干细胞？2）它们是否具有类似的肝干细胞生物学特性和修复肝脏损伤的能力？
　　肝外胆管组织包括胆囊、囊管、左右肝管、肝总管和胆总管。有研究表明，正常肝外胆管系统中存在于/前体细胞（Biliary tree stem/progenitor cells，BTSCs），并认为这些细胞具有分化为成熟肝细胞、胆管上皮细胞或胰腺内分泌细胞等类型细胞的多项分化潜能。Rohan Manohar等人在小鼠胆囊中发现并鉴定EpCAM+CD49fhi的上皮细胞具有干细胞的特征;Guido Carpino等人则利用EpCAM阳性细胞符合干细胞的特性，从人的胆囊内分离出EpCAM+K7+Lgr5+Sox17+Pdx1+的内胚层干细胞，发现分离获得的这些细胞表现出未分化细胞的特征，并且在体外具有自我更新能力以及可以被诱导分化为多种类型的细胞。然而，这些研究中“干性细胞”群体依赖表面标志物EpCAM，而这个标志物不能区分胆管上皮细胞和干细胞，具有异质性，且针对这些细胞只是简单检测了一些指标，并未深入研究细胞的相关特性。总结起来，现有研究存在的主要问题有:1）缺少肝外胆管系统干细胞的特异性分子标志;2）缺少肝外胆管系统干细胞的体外培养体系;3）体内损伤修复能力不明确。本研究围绕以上问题展开研究，试图为肝外胆管系统中干细胞是否可以作为供体细胞在临床上治疗肝病中提供线索。
　　我们实验室前期的研究表明CD63是肝内胆管干细胞特异性的表面分子标志物。因此，针对目前缺少肝外胆管系统干细胞的特异性分子标志，我们尝试以CD63为线索，来探讨小鼠和人肝外胆管系统中是否有细胞表达CD63，以及这些细胞是否具有干细胞的特性和修复肝脏损伤的能力。首先，通过原位免疫组织化学染色分别检测小鼠和人的肝外胆管内是否有细胞表达CD63，以及这些CD63+细胞是否共表达肝干细胞的分子标志。第二，以CD63为分选标志利用流式分选技术分离纯化肝外胆管系统内的细胞，并对这些细胞的体外培养体系及生物学特性进行鉴定。第三，将分离获得的CD63细胞移植到肝损伤动物模型当中，观察其是否具有再殖并修复疾病损伤的能力。
　　对于小鼠肝外胆管系统的研究发现:1）原位免疫组化染色显示，小鼠肝外胆管系统存在干性细胞，且这些细胞共表达肝干细胞分子标志CK19、EpCAM和Alb，但不表达间质相关分子标志α SMA;我们利用Ⅳ型胶原酶和胰酶联合处理消化小鼠肝外胆管组织，利用肝干细胞培养基ScmA可以将这些细胞在体外进行稳定扩增，且这些细胞在基因和蛋白水平均表达EpCAM、CK19、Alb、N-cadherin、Sox9、Pan-CK和E-Cadherin等肝干细胞分子标志，体外诱导分化实验表明这些细胞能被诱导分化为成熟肝细胞样细胞;2）鉴于CD63可以作为肝内肝干细胞特异性的分子标志，我们首先在原位鉴定了小鼠肝外胆管组织中存在CD63+细胞，且这些细胞共表达肝干细胞分子标志EpCAM、CK19、Alb和Lgr5;继而通过流式分选将小鼠肝外胆管内CD63+细胞分离纯化后，基于前期建立的肝干细胞培养基条件，通过改良后添加生长因子:bFGF和VEGF，可以将这些细胞在体外稳定培养和增殖（大于30代）;3）通过抽提RNA和细胞免疫荧光染色实验发现，这些小鼠肝外胆管CD63+细胞在基因水平和蛋白水平表达CK19、Sox9和EpCAM等肝干细胞分子标志;4）体外诱导实验显示，小鼠CD63+细胞可以被诱导为具有合成糖原、吲哚菁绿的摄入和排出及具有LDL受体等成熟肝细胞的功能和表型，以及能够形成囊管状结构（且囊管结构内的细胞具有极性）和运输罗丹明等成熟胆管上皮细胞的功能;5）将标记了绿色荧光蛋白(GFP)的小鼠CD63+细胞移植入延胡索酰乙酰乙酸脱氢酶(Fumarylacetoacetate hydrolase，Fah)基因缺陷(Fah-/-)小鼠模型中，发现这些细胞不仅可以分化为成熟肝细胞来再殖入受损的肝脏(再殖效率可高达19.69％)，还可以分化为胆管上皮细胞（再殖效率可高达10.85％），这也是首次在Fah-/-小鼠体内观察到有移植的干细胞可以分化为胆管上皮细胞。说明小鼠肝外胆管系统中CD63+细胞确实是真正的干细胞，其不仅具有肝干细胞基本特性，而且具有较好的修复肝脏损伤的能力。
　　对于人肝外胆管系统的研究发现:1）与小鼠结果类似，在人的胆囊、囊管和胆总管中均有细胞表达CD63，且这些CD63+细胞共表达肝干细胞分子标志;2）通过Ⅰ型胶原酶消化的方法可以获得肝外胆管组织的单细胞悬液，体外培养的这些细胞具有上皮样形态和高核质比等干细胞特征，且在体外可以增殖3代以上;3）以CD63为分选标志通过流式分选前后的肝外胆管细胞在基因和蛋白水平均表达肝干细胞相关分子标志。说明在人肝外胆管内存在干细胞，但是具体的分离纯化和体外培养体系还需要深入的研究。
　　综上所述，本研究发现了肝外胆管系统中干细胞的特异性表面分子标志，明确了其存在的空间位置，建立了其干细胞直接从肝外胆管组织中分离培养的技术体系，实现了其干细胞增殖与分化特性的研究。进而，完成了其干细胞在肝脏损伤小鼠模型中的再殖效率和治疗作用的评估。这些研究成果的取得，正面地回答了我们最初关于“肝外胆管干细胞是否可以作为肝脏疾病治疗用干细胞来源”的问题，为肝脏疾病研究中细胞来源匮乏问题的解决提供了一个新的思路。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

一、胆管系统中干性细胞的研究背景及现状

(一)肝内胆管系统中干／前体细胞研究现状

(二)肝外胆管系统中干性细胞的研究现状

二、本课题的研究背景、方法和目的

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

(一)小鼠肝外胆管系统中存在干性细胞

(二)小鼠肝外胆管系统干性细胞的分离和培养

(三)小鼠肝外胆管系统分离的细胞具有肝干细胞特征

二、CD63可以作为小鼠肝外胆管中干细胞特异性的分子标志

(一)小鼠肝外胆管系统中有CD63+细胞

(二)小鼠肝外胆管中CD63阳性细胞的获取和体外培养

(三)小鼠肝外胆管中CD63+细胞具有肝干细胞的基本特征

(四)小鼠CD63+细胞通过移植可修复慢性肝损伤

(五)小鼠肝外胆管CD63+细胞不具有致瘤性

三、人肝外胆管中干性细胞的初步探索

(一)人肝外胆管内有细胞表达CD63

(二)人肝外胆管系统中干性细胞的分离纯化和体外培养

(三)、分离获得的人肝外胆管细胞表达肝干细胞分子标志

讨论

参考文献

综述：干细胞在肝病细胞治疗中的研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况

致谢