靶向ErbB2双特异性抗体在胃癌中的抗肿瘤作用及其机理

摘要

在全世界范围内，每年约有70万人死于胃癌，使得胃癌导致的死亡率在所有肿瘤中高居第二位，而以包括中国在内的大部分发展中国家更是胃癌的重灾区。并且由于大部分胃癌患者均确诊于进展期，使得以包括手术和化疗在内的常规治疗手段难以发挥良好的治疗效果，因而胃癌患者的整体预后相对较差。其中，6％至23％的胃癌患者高表达人表皮生长因子受体2(ErbB2)，而该受体的高表达往往预示着更差的预后。
　　近年来随着对肿瘤分子机制的进一步了解以及对大量基础及临床试验数据的分析，人们已经认识到了靶向治疗在进展期胃癌患者中的重要性。作为临床标准疗法的曲妥珠(Trastuzumab)是一种能特异性靶向ErbB2胞外Ⅳ区的单克隆抗体，且已被证明了能够延长ErbB2高表达进展期胃癌患者的总生存期。帕妥珠(Pertuzumab)是另一个靶向ErbB2的单克隆抗体，结合ErbB2胞外Ⅱ区，其在ErbB2高表达进展期胃癌患者中也显示了积极的疗效。而Trastuzumab与Pertuzumab联合应用于ErbB2高表达进展期胃癌患者的临床试验也在进行中，并且已经初步显示出了可喜的结果。
　　尽管ErbB2靶向疗法显示了一定的疗效，但Trastuzumab和Pertuzumab的疗效仍相对温和并且在不同胃癌患者中疗效差异明显，因此提高ErbB2靶向治疗在胃癌患者中的效果显得极为重要。近几十年来，基因工程的飞速发展给我们研发及优化抗体的结构和功能提供了多种多样的选择。在前期研究中，我们通过基因工程构建了一种以Trastuzumab和Pertuzumab为亲本的双特异性抗体TPL。在本研究中，我们进一步探讨此双特异抗体在胃癌中的抗肿瘤作用及机制。
　　首先，通过MTS细胞活力检测实验，我们比较了Trastuzumab，Pertuzumab，Trastuzumab+Pertuzumab以及TPL在体外抑制ErbB2高表达胃癌细胞系N87增殖的能力。Trastuzumab+Pertuzumab联合应用比二者单用能更有效地抑制N87细胞的增殖。重要的是，双特异性抗体TPL显示出具有比Trastuzumab+Pertuzumab明显增强的抑制胃癌细胞增殖的能力。
　　随后通过荷瘤小鼠模型，我们比较了Trastuzumab，Pertuzumab，Trastuzumab+Pertuzumab以及双特异性抗体TPL的体内抑制胃癌细胞的活性。与体外实验结果一致，即Trastuzumab+Pertuzumab联用能比二者单用更为有效地抑制肿瘤的生长，但TPL具有比Trastuzumab+Pertuzumab联用更显著的抗肿瘤作用。
　　此前有研究表明，同时使用两种靶向ErbB2不同区域的单克隆抗体可通过诱导ErbB2内吞而增强靶向治疗的效果。考虑到这可能是双特异性抗体TPL发挥显著抗瘤作用的机制之一，我们比较了Trastuzumab，Pertuzumab，Trastuzumab+Pertuzumab以及双特异性抗体TPL诱导ErbB2内吞的能力。流式细胞术分析以及免疫荧光共聚焦实验表明，单独的Trastuzumab和Pertuzumab在8小时内均不能诱导ErbB2明显内吞，而Trastuzumab+Pertuzumab联用组在处理8小时后才能诱导ErbB2微弱的内吞。但TPL处理N87细胞2小时后就可导致ErbB2发生一定程度的内吞，处理8小时后可引起更为显著的ErbB2内吞。
　　为了进一步阐明靶向ErbB2不同表位抗体组合与其诱导ErbB2内吞能力之间的关系，我们在随后的研究中通过标准杂交瘤技术获得了靶向ErbB2的5株特异性单克隆抗体。这5株单克隆抗体加上Trastuzumab和Pertuzumab可以两两组成21对抗体组合。通过ELISA竞争抑制试验，我们从这21对抗体组合中鉴定出了18对不竞争结合ErbB2的组合。但是免疫荧光共聚焦实验证明，这18对抗体组合中只有其中4对抗体组合能引起明显的ErbB2内吞。
　　综上所述，我们的研究表明通过基因工程构建的双特异性抗体TPL能引起ErbB2的明显内吞并借此在体内外均展示出良好的抗肿瘤活性，该双特异性抗体也有可能发展成为ErbB2高表达进展期胃癌患者的一种新的有效靶向制剂。此外，对于靶向ErbB2不同表位的单克隆抗体组合而言，只有其中特定的抗体组合才能有效诱导ErbB2内吞，这可能与抗体所识别的具体表位有关。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 双特异性抗体TPL在胃癌中的抗肿瘤作用研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验结果分析与讨论

第二部分 双特异性抗体TPL在胃癌中的抗肿瘤作用机理研究

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验结果分析与讨论

全文小结

参考文献

综述 单克隆抗体治疗恶性肿瘤的耐药机制研究进展

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢