基于上转发光免疫层析技术快速定量检测类鼻疽伯克霍尔德菌与土拉弗朗西斯菌的方法研究

摘要

目的:
　　建立可对烈性病原体类鼻疽伯克霍尔德氏菌与土拉弗朗西斯氏菌直接进行现场检测的上转发光免疫层析(up-converting phosphor technology-based lateral-flow，UPT-LF)快速定量检测方法。
　　方法:
　　1.上转发光免疫层析检测试纸制备:以类鼻疽伯克霍尔德氏菌、土拉弗朗西斯氏菌相应的单克隆抗体作为特异性生物检测探针，以上转发光颗粒(up-convertingphosphor，UCP)为分析标记物，分别建立双抗体夹心模式免疫层析试纸:类鼻疽伯克霍尔德氏菌上转发光免疫层析检测试纸(Bur-UPT-LF)和土拉弗朗西斯氏菌上转发光免疫层析检测试纸(Fra-UPT-LF)。
　　2.试纸检测敏感性及特异性评价:以类鼻疽伯克霍尔德氏菌系列浓度菌悬液作为标准样品，评价Bur-UPT-LF的敏感性和定量能力;采用鼻疽伯克霍尔德氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、铜绿假单胞菌等30株种属近缘或传播途径近似的菌株进行特异性评价。以土拉弗朗西斯氏菌系列浓度菌悬液作为标准样品，评价Fra-UPT-LF的敏感性和定量能力;采用鼠疫耶尔森氏菌、炭疽芽孢、伤寒沙门氏菌等18株传播途径或感染症状类似的菌株进行特异性评价。
　　3.试纸现场检测适用性模拟评价:(1)样品耐受性评价，采用不同浓度的纯化学试剂（4类7种）和模拟样品（8类15种）分别进行试纸对单因素样本和实际样品的耐受性评价。(2)操作误差兼容性评价，设置一定程度的操作误差，包括样品体积偏差、样品处理液体积偏差、上样体积偏差，模拟实验室外、现场非精确操作条件下对试纸检测性能的影响。
　　结果:
　　1.上转发光免疫层析检测试纸制备:将上转发光颗粒与抗类鼻疽伯克霍尔德氏菌单克隆抗体(2E5、3D6、8G1)进行生物偶联;抗类鼻疽伯克霍尔德氏菌单克隆抗体186(3 mg/ml)和羊抗鼠IgG(3 mg/ml)分别作为检测带(T)和质控带(C)固定在硝酸纤维素膜上，成功建立了Bur-UPT-LF试纸，并确定了最优样品处理液（样品垫处理液含1％NaCl)。将上转发光颗粒与抗土拉弗朗西斯氏菌单克隆抗体12H1进行生物偶联;抗土拉弗朗西斯氏菌单克隆抗体(4H10+1C5)(2 mg/ml)和羊抗鼠IgG(2 mg/ml)分别作为检测带(T)和质控带(C)固定在硝酸纤维素膜上，成功建立了Fra-UPT-LF试纸，并确定了最优样品处理液(样品垫处理液含1％ BSA)。
　　2.试纸检测敏感性及特异性评价:Bur-UPT-LF检测限为104 cfu/ml;在104cfu/ml～107 cfu/ml的范围内具有优良的线性定量检测能力（r=0.996）;特异性佳，与鼻疽伯克霍尔德氏菌、常见细菌类生物战剂以及环境菌群等均无交叉反应。Fra-UPT-LF检测限为104 cfu/ml;在104 cfu/ml～108 cfu/ml的范围内具有优良的线性定量检测能力（r=0.995）;特异性佳，与常见细菌类生物战剂以及环境菌群等均无交叉反应。
　　3.试纸现场检测适用性模拟评价:(1)两种检测试纸均具有较强的样品单因素冲击耐受性。Bur-UPT-LF试纸可耐受pH1-12(即HCl≤0.1 mol/L、NaOH≤0.01 mol/L)，离子强度≤2 mol/L(NaCl+KCl≤2 mol/L)，粘稠度PEG20000≤50 mg/ml与甘油≤20％,生物大分子基质干扰BSA≥400 mg/ml与干酪素≥80 mg/ml等。Fra-UPT-LF试纸可耐受pH2-13(HCl≤0.01 mol/L、NaOH≥0.1 mol/L)，离子强度≥2 mol/L(NaCl+KCl≥2 mol/L)，粘稠度PEG20000≤50 mg/ml与甘油≥20％，生物大分子基质干扰BSA≥400 mg/ml与干酪素≥80 mg/ml等。(2)两种检测试纸均可在20min内对面粉、奶粉、腻子粉、土壤、果珍以及脏器等复杂样品中的类鼻疽伯克霍尔德氏菌、土拉弗朗西斯氏菌进行准确定量检测;(3)样品体积偏差(-50％～+200％)、样品处理液体积偏差(-22％～+44％)或上样体积偏差(-30％～+30％)等操作误差对两种试纸的检测敏感性和特异性均无影响。
　　结论:
　　本研究建立的分别可对类鼻疽伯克霍尔德氏菌、土拉弗朗西斯氏菌进行快速定量检测的UPT-LF简便快速，具有良好的敏感性和特异性，并且具有较强的样品耐受性和操作误差耐受性，现场适应性极强，可以满足现场复杂条件下病原监测、调查与检测的需求。

目录

摘要

符号说明

前言

第一部分 UPT-LF试纸研制

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分 UPT-LF试纸性能评价

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

综述 病原微生物快速检测新技术研究进展

致谢

攻读学位期问发表的学术论文

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