牛奶中四环素类药物多残留RP-HPLC检测方法的建立

摘要

本试验旨在通过对四环素类药物色谱分离条件的优化与筛选，分析不同洗脱模式对四环素类药物分离的影响；采用梯度洗脱模式和固相萃取等技术，建立了能同时检测牛奶样品中二甲胺四环素、四环素、金霉素、土霉素、多西环素、去甲基金霉素、甲烯土霉素7种抗生素残留量的反相高效液相色谱方法。 1．四环素类药物色谱分离条件的筛选和优化在色谱分离条件的建立中，结合7种四环素类药物理化性质和结构特点，分析了影响四环素类药物分离因素；经过对流动相缓冲液浓度、配比、酸度、流速以及检测波长的多次试验优化和改进现行国家标准中测定四环素类药物的洗脱方式，最终筛选和建立了采用SunfireTM C18(250 mm×4.6mm，5 μm)柱为色谱柱，以甲醇-乙腈-0.01 mol/L草酸为流动相，流速为10ml/min和检测波长为355nm的快速分离7种四环素类药物的色谱条件。 2．梯度洗脱模式的构建及其影响因子的分析通过对四环素类药物的梯度洗脱条件及其影响因素的系统分析，结果表明，在梯度洗脱模式下，洗脱时间与分离度成正相关；梯度陡度与分离度成负相关；改变有机相浓度变化范围和梯度洗脱程序曲线形状可以获得最佳的分离效果。建立了可使二甲胺四环素等7种四环素类药物达到基线分离的最佳梯度洗脱条件。 3．利用固相萃取技术检测牛奶中7种四环素类药物残留本实验采用固相萃取技术，分析和探讨了影响牛奶样品中7种四环素类药物残留的提取、净化和浓缩等过程的主要因素。建立了以pH为4的Mellvaine-EDTA-三氯乙酸缓冲液为提取液的工艺流程；确定了以30％的甲醇水溶液为淋洗试剂(淋洗体积为8mL)、以甲醇-乙酸乙酯溶液作为洗脱液(洗脱速率为1.0mL/min)的HLB固相萃取柱净化的最佳条件。通过前处理方法的得到的7种四环素类抗生素的线性范围宽，峰面积和样品浓度在0.02～1.0μg/mL呈良好的线性关系，加标平均回收率在78.66％～106％，最低检测限为0.02μg/mL。 分析评价结果表明，该方法操作简单、重现性好、检测限低、灵敏可靠，并显著降低了分析检测时间，可在18min内能同时将二甲胺四环素等7种四环素类药物达到基线分离。特别是在对牛奶中四环素类抗生素残量的分析时，其最低检测限可达0.02μg/mL，远远低于欧美国家法规中规定的最大残留量，同时回收率均大于78％，而标准偏差小于5.76％。因此，该方法可应用于牛奶中四环素类药物多残留的快速分析，为进一步进行LC-MS确证检测提供了技术依据。

目录

文摘

英文文摘

前言

声明

第一章牛奶中兽药残留研究概况

1.1牛奶中抗生素残留的简介

1.1.1牛奶中抗生素残留的来源及其危害

1.1.2牛奶中抗生素的残留现状

1.2四环素类药物的简介

1.2.1四环素类药物化学结构和理化性质

1.2.2药物动力学机理

1.2.3药理作用

1.2.4四环素类药物的残留与危害

1.2.5四环素类药物检测方法的研究进展

1.3四环素类药物检测器的类型与应用

1.3.1紫外和可见光吸收分光光度检测器

1.3.2荧光检测器[129-130]

1.4四环素类抗生素检测生物样品前处理技术

1.4.1生物样品的种类及样品前处理

1.5牛奶中四环素类药物残留分析方法的评价

1.5.1准确度

1.5.2精密度

1.5.3灵敏度

1.5.3方法的专属性

1.5.4线性范围

1.6牛奶中四环素类抗生素残量分析的意义

第二章四环素类药物色谱分离条件的筛选和优化

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2药品与试剂

2.2实验方法

2.2.1标准品系列溶液的稳定性研究

2.2.2色谱分离条件的筛选与优化

2.3结果

2.3.1标准品系列溶液的稳定性研究

2.3.2色谱分离条件的筛选与优化

2.4讨论

2.4.1四环素类药物标准品的配制与储存

2.4.2四环素类药物检测的色谱条件的筛选与优化

2.5小结

第三章梯度洗脱模式的构建及其影响因子的分析

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2药品与试剂

3.2实验方法

3.2.1标准储备液、中间标准液和标准工作液的配制

3.2.2色谱条件

3.2.3梯度洗脱影响因子

3.2.4分析方法指标试验

3.3结果

3.3.1梯度洗脱时间对分离的影响

3.3.2有机相浓度变化范围对分离的影响

3.3.3梯度陡度对保留值的影响

3.3.4柱温对各组分保留值的影响

3.3.5梯度洗脱程序曲线形状对分离的影响

3.3.6梯度模式下检测波长对分离的影响

3.3.7分析方法评价结果

3.4讨论

3.5小结

第四章利用固相萃取技术检测牛奶中7种四环素类药物残留

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2实验方法

4.1.3方法的实用性考察

4.2结果

4.2.1提取方法的筛选和确定

4.2.2固相萃取柱的选择

4.2.3淋洗液的筛选

4.2.4洗脱液的确定

4.2.5方法的回收率和精密度

4.2.6方法的重现性

4.2.7方法的专属性和特征图谱

4.2.8方法适用性考察

4.3讨论

4.3.1牛奶中四环素类药物提取条件的筛选

4.3.2净化方法的选择

4.3.3方法的检测限和回收率

4.3.4适用性考察

4.4小结

结论

参考文献

致谢

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