陕西省四种不同寄主上二斑叶螨体内Wolbachia菌wsp基因的克隆和序列分析

摘要

Wolbachia是存在于节肢动物体内的一类呈母系遗传的细胞内共生细菌，可以通过卵的细胞质传播并参与调控寄主的多种生殖活动，如诱导孤雌生殖、细胞质不亲和等。Wolbachia可能是自然界中分布最广、丰度最大的共生细菌类群。wsp基因是一种编码Wolbachia表面蛋白的基因，相对于16S rDNA、ftsZ基因等DNA区段，wsp基因进化速度更快，可以更好地揭示Wolbachia与其寄主之间的相互关系。 二斑叶螨(Tetranychus urticae Koch)分布范围广，寄主植物多。在陕西果区近年来由于农药的大量使用和使用不当，其抗性问题使得其成为果树上的主要害虫。所造成的危害比其它农作物害虫更严重。而近年的研究证明，昆虫的孤雌生殖可能与其体内的共生微生物关系密切，所以利用共生菌Wolbachia诱导的异常生殖行为，如孤雌生殖，雄性化等，实现种群替代，也就是将现有的种群替换为同物种中比原来种群危害小的另一种群，也许是更加有效地防止叶螨科害螨的方法之一。 特别是近来来提倡的无公害优质苹果的生产技术的应用，采用共生菌防止果区二斑叶螨是做到真正的无公害生产的可行途径。本文采用Wolbachia的通用引物对寄生在桃树、枣树、苹果、黄堇上的二斑叶螨体内的Wolbachia进行了检测，并对其wsp基因进行PCR扩增和测序，其次对测序结果利用DNAMAN6软件在Phylogenetie tree Observed Divergency模型下，各个分支的Bootstrap置信度用1000次自导复制来评价进行对测序结果经行同源性比较和基因特征分析。结果表明：在这四种寄主上的二斑叶螨均被Wolbachia感染；扩增出的片段大小为596bp。其中苹果和桃树上二斑叶螨体内感染的Wolbachia同源性最高达100％；黄堇和苹果的同源性最低达99.2％。而且经过系统发育分析发现它们全部与B组的Ori亚群的Wolbachia株十分相近或相同。总体来说，他们的簇类关系上呈平行分布，没有明显的不同寄主上的差异。

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第一章文献综述

1.1防治二斑叶螨的经济意义

1.2 Wolbachia的发现和目前的研究进展

1.3 Wolbachia的形态学与在体内的分布

1.4.Wolbachia的多样性和系统分化

1.5 Wolbachia的水平传播

1.6 Wolbachia的应用前景

1.6.1 Wolbachia与物种形成

1.6.2 Wolbachia诱导的CI在生物防治上的应用

1.6.3 Wolbachia诱导的PI在生物防治上的应用

1.7 Wolbachia的检测技术

1.8 Wolbachia对宿主生殖活动的调控

1.8.1胞质不亲和(cytoplasmic incompatibility,CI)

1.8.2杀雄(male-killing)

1.8.3雌性化(feminization)

1.8.4诱导孤雌生殖(parthenogenesis inducing，PI)

第二章材料与方法

2.1材料与试剂

2.1.1供试虫源

2.1.2试剂

2.1.3仪器

2.1.4受体菌和载体

2.2二斑叶螨体内Wolbachia的wsp基因序列测定与系统发育分析

2.2.1总DNA的提取

2.2.2 WSP基因的PCR扩增和电泳检测

2.2.3 PCR扩增产物的回收

2.2.4连接反应

2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.6转化和筛选

2.2.7重组质粒DNA的少量提取

2.2.8重组质粒鉴定

2.2.9目的片段的序列测定、分析及系统进化树的构建

2.2.10 WSP基因的系统发育分析和同源性比较

第三章结果与讨论

3.1结果

3.1.1二斑叶螨Wolbachia的感染情况

3.1.2二斑叶螨体内Wolbachia的wsp基因序列

3.1.3二斑叶螨体内Wolbachia的wsp基因同源性分析

3.2讨论

参考文献

致谢

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