贮藏苹果中展青霉素产生菌的分离鉴定和生长代谢特征研究

摘要

展青霉素(Patulin，Pat)是一种对动物具有致畸、致癌和致突变性的真菌次生代谢产物毒素。展青霉素污染问题已严重影响我国苹果及苹果汁质量安全，并限制了我国苹果汁的可持续出口，有效控制和降低苹果及苹果产品中展青霉素含量成为国内外研究的热点。苹果中的展青霉素主要来源于原料中产生菌的污染，虽然人们已在苹果汁生产加工过程中对展青霉素的控制方面取得了一些成果，但是并没有从根本上解决展青霉素的毒害问题，为此还应该从展青霉素产生菌的生长和毒素产生的抑制方面进行更加深入和广泛的研究，本研究对源于苹果贮藏库的陕西不同品种和产地的苹果原料中的展青霉素产生菌进行了分离，通过形态学鉴定和ITS区序列分析，鉴定了苹果中主要展青霉素产生菌生物学分类，并通过构建系统发育树确定了它们之间的系统发育关系，对展青霉素产生菌的可靠生物信息进行了追溯，在此基础上研究了苹果中主要展青霉素产生菌的产毒特征和高产毒菌株基于产毒培养基和苹果汁培养基的生长代谢动力学特征，为从根源上控制苹果及苹果产品中展青霉素的产生提供了理论依据。 本研究主要得到以下结果： (1)从贮藏库不同品种和产地的苹果原料中分离纯化得到10株不同产毒能力的展青霉素产生菌。 (2)通过形态学方法初步鉴定了10株展青霉素产生菌中1号、8号菌株为曲霉属菌株，其他8株为青霉属菌株。进一步利用真菌ITS序列分析技术，获得了可靠性鉴定结果：1号菌为Aspergillus sydowii、2号菌Penicillium paneum、3号菌Penicilliumgriseofulvum、4号菌Penicillium chrysogenum、5号菌Penicillium expansum、6号菌Penicillium expansum、7号菌Penicillium chrysogenum、8号菌Aspergillus oryzae、9号菌Penicillium expansum、10号菌Penicillium expansum。 (3)根据10株菌ITS区测序结果，构建了10株展青霉素产生菌的系统发育树，表明苹果中的10株展青霉素产生菌之间具有不同程度的亲缘关系。 (4)分析了苹果中主要的展青霉素产生菌和产毒量的关系，表明苹果汁中展青霉素主要源于青霉属菌株。 (5)对于不同的展青霉素产生菌株，静置培养和摇瓶培养对其产毒具有不同程度的影响作用。对大多数展青霉素产生菌而言，静置培养相对利于展青霉素的代谢，而且不同的产毒培养基对展青霉素产生菌具有明显的影响，特别是添加Mn2+能够不同程度地增加展青霉素的产量。 (6)在酵母膏葡萄糖液体培养基的基础上，应用Plackett-Burman试验设计和响应面分析方法，对展青霉素产生菌Penicillium grisefulvum的产毒培养条件进行了系统优化，得到展青霉素最高含量时的产毒培养条件为：葡萄糖75.86g/L、接种量0.92％、MnCl2·4H2O 0.03g/L，酵母膏1.0g/L、蛋白胨1.0g/L、pH值自然、装液量50mL/250mL、温度25℃，优化后培养条件下Penicillium griseofulvum代谢产生展青霉素含量达528.25mg/L。 (7)通过4因素二次正交旋转组合试验得知，展青霉素产生菌Penicillium griseofulvum在苹果汁营养体系中，接种量对菌株代谢产生展青霉素有影响显著，温度、可溶性固形物含量和pH值对响应值展青霉素含量影响不显著，该菌株代谢展青霉素的最佳组合为：可溶性固形物含量10.86％，接种量0.92％，pH值4.7、温度25℃，此条件下可以得到展青霉素最大产量为483.79mg/L。 (8)分别在优化产毒培养基和基于苹果汁的优化产毒培养条件下，构建了Penicillium griseofulvum菌体生长、展青霉素生成和底物消耗的动力学模型。该菌株在两种不同的培养体系中该菌株呈现了大体相似的生长代谢和产毒特征，可用共同的菌体生长、产物生成和底物消耗模型来较好模拟该菌株的生长代谢动力学特征，而且所得出的两种不同培养体系下展青霉素产生菌的动力学模型与试验值能够较好的吻合，可以为展青霉素产生菌的生长繁殖和代谢产毒预测控制提供一定的理论基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1苹果及苹果汁概述

1.1.1苹果的生物学性质和营养保健功能

1.1.2我国苹果及苹果汁产业现状

1.1.3我国苹果及苹果汁产业存在的主要问题

1.2展青霉素概述

1.2.1展青霉素的理化性质

1.2.2展青霉素的毒性及限量

1.2.3展青霉素的检测方法

1.2.4展青霉素的来源及在食品中的污染状况

1.3苹果(汁)中的展青霉素

1.3.1苹果中的展青霉素产生菌

1.3.2苹果(汁)中展青霉素的污染

1.4苹果(汁)中展青霉素控制技术研究

1.4.1展青霉素控制技术研究进展

1.4.2展青霉素控制技术存在的问题与展望

1.5 ITS序列分析在真菌分类学上的应用

1.5.1 ITS序列分析的特征和结构

1.5.2 ITS序列分析的应用原理和研究方法

1.5.3 ITS序列标记在真菌分类鉴定中的应用及前景

1.6本研究的目的及内容

1.6.1研究的目的意义

1.6.2研究的主要内容

1.6.3研究的技术路线

第二章贮藏苹果中展青霉素产生菌的分离和鉴定

2.1材料与方法

2.1.1材料、试剂、仪器

2.1.2试验方法

2.2结果与分析

2.2.1分离菌株代谢产生展青霉素分析

2.2.2菌种形态学鉴定结果与分析

2.2.3分离菌株的ITS区序列测定结果与分析

2.3 小结

第三章分离菌株代谢产生展青霉素特征研究

3.1材料与方法

3.1.1材料、试剂和仪器

3.1.2试验方法

3.2结果与分析

3.2.1不同培养方式对菌株的产毒影响

3.2.2不同培养基对菌株产毒的影响

3.2.3 Mn2+对展青霉素产生菌能力的影响

3.3 小结

第四章基于培养基的Penicillium griseofulvum生长代谢动力学研究

4.1材料与方法

4.1.1材料、试剂和仪器

4.1.2试验方法

4.2结果与分析

4.2.1培养基与培养条件优化

4.2.2 Penicillium griseofulvum在培养基优化条件下的生长代谢动力学

4.3小结

第五章基于苹果汁培养基的Penicillium griseofulvum生长代谢动力学研究

5.1材料与方法

5.1.1材料、试剂和仪器

5.1.2试验方法

5.2结果与分析

5.2.1培养基与培养条件优化

5.2.2 Penicillium griseofulvum在优化条件下的生长代谢动力学

5.2.3不同培养条件下菌株代谢动力学对比分析

5.3小结

第六章结论与讨论

6.1结论

6.2讨论

参考文献

附录

致谢

作者简介