miR-378a-3p、miR-107和相关circRNA调控牛肌细胞发育的机制研究

摘要

肌肉发育是影响产肉量及肉品质的重要因素之一，肌肉发育主要依赖于肌细胞增殖、分化。肌细胞增殖、分化过程涉及多基因的表达、信号传导及网络式调控，受到众多因素的调节。尽管肌肉发育的分子机制一直是发育生物学的重点研究对象，但至今为止仍然有相当数量的肌发生调节因子有待鉴定。miRNA是组织当中存在的主要的小RNA，长度约为18～24nt的单链小分子RNA，由茎环结构的Drosha和Dicer两种核糖核酸酶Ⅲ蛋白加工而成。近年来研究发现miRNAs在肌肉发育中有重要的调控作用，且关于miRNA的研究主要集中在调控下游靶基因方面，对影响miRNA自身表达水平的因素研究较少，而关于牛肌肉发育中miRNA的研究更少，且调控机制仍不清楚。另有报道环状RNA可作为miRNA分子海绵调控miRNA发挥功能，但牛肌肉中是否存在circRNA，且功能如何还未见报道。因此，本研究以高通量测序为基础分析牛肌肉组织中miRNAs及circRNAs表达，通过超表达、干扰手段，利用实时荧光定量PCR、双荧光素酶基因报告系统、CCK-8、EdU法、流式细胞仪检测法等技术，研究了miRNAs、circRNAs在肌肉细胞增殖、分化中的作用机制，及circRNA与miRNA之间的调控关系，构建关于circRNA-miRNA-mRNA的调控网络，揭示牛肌肉发育调控机制，为秦川牛分子育种提供新的理论依据。主要研究结果如下:
　　1.miR-378a-3p通过靶基因HDAC4调控肌细胞增殖、分化及凋亡
　　从前期秦川牛骨骼肌miRNAs高通量测序结果中鉴定发现miR-378a-3p在肌肉组织中的表达量显著高于其他组织，通过CCK-8、EdU及qRT-PCR等方法检测miR-378a-3p对肌细胞增殖的作用，结果显示超表达miR-378a-3p可显著降低肌细胞增殖系数及增殖标志基因cyclinD1表达量，表明肌细胞增殖受到抑制;同时，超表达miR-378a-3p能够下调细胞凋亡抑制因子BCL-2基因表达水平，上调凋亡诱导因子BAX和caspase-3基因表达水平，从而促进肌细胞凋亡。另外，超表达miR-378a-3p显著上调肌分化因子MyoD和MyHC基因mRNA和蛋白质表达水平，促进肌细胞分化、肌管产生。机制研究发现miR-378a-3p通过抑制靶基因HDAC4转录后翻译水平，从而抑制肌细胞增殖，促进肌细胞的分化和凋亡。
　　2.miR-107通过调控靶基因Wnt3a抑制牛肌细胞的增殖、分化
　　miR-107由牛26号染色体泛酸激酶1基因(PANK1)第7内含子转录而来，与人和小鼠序列高度保守，在肌肉组织中有较高的表达水平。超表达miR-107显著下调肌分化因子MyHC、MyoD和MyoG基因mRNA及蛋白质表达水平，抑制肌细胞分化;降低细胞增殖系数和增殖标志基因PCNA表达。同时，超表达miR-107调控肌细胞凋亡因子BCL-2、p53和caspase9基因mRNA表达和蛋白质翻译水平。由TargetScan软件预测并通过双荧光素酶报告系统证明Wnt3a基因是miR-107的一个直接靶基因。超表达miR-107显著降低Wnt3a基因mRNA和蛋白表达水平，而siRNA干扰Wnt3a基因，可显著抑制肌细胞分化、增殖及凋亡;这些结果表明miR-107可通抑制控靶基因Wnt3a的表达水平而调控肌细胞的分化、增殖和凋亡，可作为牛分子育种的另一分子标记。
　　3.秦川牛肌肉组织circRNAs的鉴定及筛选
　　为研究秦川牛肌肉组织中是否存在与肌肉发育相关circRNA，本研究利用去除核糖体RNA高通量测序技术，鉴定秦川牛肌肉组织胚胎和成年牛肌肉中circRNAs表达情况，得到了12，981个候选circRNAs，其中2400个circRNAs在胚胎和成年期肌肉组织中同时存在。特征分析显示大多数circRNA转录长度不足2000核苷酸(nt)，平均长度为822nt，含2～7个外显子，远小于其相对的蛋白编码基因的转录本长度。circRNAs在所有染色上广泛分布，染色体越长，产生circRNA数目越多。不同时期表达差异分析，得到了828个差异表达的circRNAs，其中624个上调，204个下调，表明表达差异的circRNA可能在牛肌肉发育过程中发挥着重要作用。通过qRT-PCR分析了17个表达差异的circRNAs，结果与circRNA测序结果一致，表明测序结果的准确性，同时发现circRNA42在肌肉发育过程中下调程度最大，暗示其在肌肉发育中可能具有重要功能。
　　4.circLMO7通过吸附miR-378a-3p调控牛肌肉原代细胞增殖、分化及凋亡
　　circLMO7（circRNA42）来源于LMO7基因，全长2，312nt，包含9个外显子，在肌肉组织中表达量显著高于其他组织。经RNAhybrid软件预测发现circLMO7序列中有一个miR-378a-3p结合位点，双荧光素酶报告系统检测表明circLMO7与miR-378a-3p靶向结合，且超表达circLMO7(pcDNA-circLMO7)能显著降低miR-378a-3p表达量。利用CCK-8、EdU法及qRT-PCR等技术检测发现，circLMO7促进肌细胞增殖，上调增殖标志基因cyclinD1表达;同时circLMO7抑制肌细胞的凋亡，促进凋亡相关标志基因BCL-2在mRNA和蛋白水平的表达，抑制BAX和caspase9基因mRNA表达及蛋白翻译水平。另外，circLMO7显著下调肌肉分化标志基因MHC、MyoG和MyoD的表达水平，抑制肌细胞分化和肌管的产生。这些结果与超表达miR-378a-3p对细胞增殖、分化等的作用相反，同时circLMO7能增强miR-378a-3p靶基因HDAC4表达水平。综合以上结果表明circLMO7能够通过结合miR-378a-3p解除miR-378a-3p对靶基因HDAC4基因表达的抑制作用，进而调控肌细胞的增殖、分化及凋亡。本章研究揭示了circLMO7可能作为miR-378a-3p的上游调控因子，影响牛肌肉发育。
　　本研究为揭示秦川牛肌肉发育分子调控机理积累了基础资料并提供了新的研究思路，同时为非编码RNA的机制研究增添了新的证据，也为我国良种肉牛的资源保护和分子育种提供了新的分子标记。

目录

论文说明

声明

摘要

前言

第一章 非编码RNA研究进展

1．1 miRNAs的研究进展

1．1．1 miRNAs的来源与形成机制

1．1．2 miRNAs的作用机制

1．1．3 miRNAs靶基因的筛选与鉴定

1．1．4 miRNAs在肌肉发育中的作用

1．1．5 miRNAs在牛上的研究现状

1．1．6 miRNAs与环状RNA的调控关系

1．2 环状RNA的研究进展

1．2．1 环状RNA的发现

1．2．2 环状RNA的产生及分子特征

1．2．3 环状RNA的分类

1．2．4 环状RNA的功能与作用机制

1．2．5 环状RNA的研究现状

1．2．6 环状RNA在肌肉发育中的作用

1．3 本研究的目的和意义

第二章 牛肌肉发育相关miR-378a-3p通过靶基因HDAC4调控肌细胞增殖、分化及凋亡

2．1 材料与方法

2．1．1 样品采集

2．1．2 牛肌肉原代细胞分离培养

2．1．3 载体的构建

2．1．4 细胞增殖试验

2．1．5 细胞凋亡试验

2．1．6 细胞免疫荧光试验

2．1．7 靶基因预测及双荧光素酶活性分析

2．1．8 RNA提取、cDNA合成及qRT-PCR

2．1．9 蛋白提取及免疫印记试验(Western blot)

2．1．10 统计分析

2．2 结果与分析

2．2．2 miR-378a-3p抑制细胞增殖

2．2．3 miR-378a-3p促进细胞分化

2．2．4 miR-378a-3p促进细胞凋亡

2．2．5 双荧光素酶报告系统验证miR-378a-3p与HDAC4基因靶向关系

2．2．6 干扰HDAC4基因抑制细胞增殖，促进细胞分化及凋亡

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 牛肌肉发育相关miR-107通过靶基因Wnt3a调控肌细胞增殖、分化及凋亡

3．1 材料与方法

3．1．1 牛肌肉原代细胞分离培养

3．1．2 miR-107相关载体的构建

3．1．3 细胞增殖、凋亡检测试验

3．1．4 细胞免疫荧光试验

3．1．5 靶基因预测及双荧光素酶活性分析

3．1．6 RNA提取、cDNA合成及qRT-PCR

3．1．7 蛋白印记试验(Western blot)

3．1．8 统计分析

3．2．1 miR-107筛选及其在不同组织中表达分析

3．2．2 miR-107抑制肌细胞分化

3．2．3 miR-107抑制肌细胞增殖

3．2．4 miR-107抑制肌细胞凋亡

3．2．5 miR-107靶基因Wnt3a的鉴定

3．2．6 干扰Wnt3a基因抑制细胞增殖、分化及凋亡

3．3 讨论

5．4 小结

第四章 秦川牛肌肉发育相关circRNAs的鉴定

4．1 材料与方法

4．1．1 样品采集

4．1．2 测序文库构建及高通量测序

4．1．3 circRNA的鉴定及注释

4．1．4 circRNA差异表达分析

4．1．5 总RNA的提取、cDNA的合成及荧光定量PCR试验

4．2 结果与分析

4．2．1 秦川牛肌肉组织RNA提取和质检

4．2．2 肌肉组织circRNA高通量测序

4．2．3 circRNAs的特征分析

4．2．4 circRNA表达差异性分析

4．2．5 circRNA qRT-PCR验证

4．3 讨论

4．4 小结

第五章 circRNA调控牛肌肉原代细胞增殖、分化及凋亡的机理研究

5．1 材料与方法

5．1．1 牛肌肉原代细胞分离培养

5．1．2 circRNA相关载体的构建

5．1．3 细胞增殖、周期及细胞凋亡检测试验

5．1．6 RNA提取、cDNA合成及qRT-PCR

5．1．7 蛋白印记试验(Western blot)

5．1．8 统计分析

5．2 结果与分析

5．2．1 circLMO7在不同组织中表达水平分析

5．2．2 双荧光素酶报告试验

5．2．3 circLMO7促进细胞增殖

5．2．4 circLMO7抑制细胞分化

5．2．5 circLMO7影响细胞凋亡

5．2．6 circLMO7结合miR-378a-3p解除HDAC4抑制作用

5．3 讨论

5．4 小结

结论

创新点

参考文献

附录

致谢

作者简介