埋置白三叶对苹果园土壤硝化反硝化微生物多样性的影响研究

摘要

黄土高原是我国重要的苹果主产区。为追求高产长期过度施用氮肥，导致土壤N素的大量流失，引发一系列的环境问题，如N2O使全球气候变暖，NO3-对地下水的污染，以及NH3的富营养化等。另外化肥的过量施入也会导致土壤质量、苹果产量和品质的下降。果园生草埋置是适应该区特殊气候条件、改善土壤有机质缺乏和提高土壤肥力与果品质量的有效途径。目前，对苹果园牧草降解的研究刚刚起步，且主要集中在牧草降解后对果园土壤有机质、肥力、酶活性、土壤细菌、真菌的数量等方面，均没有涉及果园土壤氮循环硝化反硝化作用微生物的研究。为此，本研究在苹果园埋置黄土高原苹果园最适宜的牧草白三叶（Trifolium repensL.）的茎叶，设BW1(埋置白三叶1kg)、BW3(埋置白三叶3kg)和BW5（埋置白三叶5kg）三个处理，以不埋置白三叶的土壤为对照，分别在白三叶降解了1、2、3、6和12个月时采集土壤样品，通过定量PCR(qPCR)、限制性酶切多态性（T-RFLP）和高通量测序的方法，研究了埋置白三叶后苹果园土壤硝化反硝化微生物群落的多样性。主要结果如下:
　　(1)苹果园土壤全量养分、速效养分、铵态氮、硝态氮、有机质的含量在埋置白三叶后都呈增加趋势，且随着埋置量的增加而增多。
　　(2)0～10cm和10～20cm土层，各功能基因的丰度变化基本一致。氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的丰度在埋置前期和埋置后期增加，而nirK型、nirS型和nosZ型反硝化菌的丰度在埋置前期降低，埋置中期基本无变化。埋置前期，AOB和AOA的丰度在3kg的埋置量中显著增加。大多数埋置时间，nirK型反硝纯菌的丰度随埋置量的增加而增加。相关性分析表明速效钾含量影响AOB和nirK型反硝化细菌的丰度。AOA和nosZ型反硝化细菌的丰度与铵态氮含量和pH正相关。nirS型反硝化细菌的丰度与土壤性质之间的相关关系不显著。
　　(3)氨氧化细菌(AOB)和氨氧化吉菌(AOA)及nirK型、nirS型和nosZ型反硝化菌中优势菌群的相对丰度变化，改变了群落组成。0～10cm土层和10～20cm土层氨氧化细菌(AOB)的群落结构不同。埋置12个月时，氨氧化古菌(AOA)和nosZ型反硝化菌的群落结构和其它埋置时间点不同。AOB的群落结构对土壤钾含量有明显响应，土壤水分是一个重要因子，影响着AOA和nirK型、nosZ型反硝化细菌的群落结构。
　　(4)应用Illumina Miseq高通量测序平台研究了埋置3kg白三叶一个月后氨氧化细菌和反硝化细菌的群落结构。研究结果表明，氨氧化细菌(AOB)，nirS型和nosZ型反硝化细菌的香农维纳多样性指数(Shannon)和丰富度指数(Chao)增加，而均匀度指数(Simpson)下降。AOB的序列包括β-变形菌纲(β-proteobacteria)的亚硝化螺菌属（Nitrosospira），亚硝化单胞属（Nitrosomonas）和亚硝化弧菌属（Nitrosovibrio），但以亚硝化螺菌属为主导。埋置3kg白三叶处理中亚硝化螺菌属的相对丰度增加。nirS型反硝化菌的优势属有贪铜菌属（Cupriavidus），Ideonella属，红长命菌属（Rubrivivax），Sulfuritalea属。其中，优势种群贪铜菌属（Cupriavidus）的丰度在埋置白三叶后增加了60.90％，Ideonella属，红长命菌属（Rubrivivax），Sulfuritalea属，这三类优势属的丰度在埋置白三叶后降低。nosZ型反硝化菌主要包括α变形菌纲(Alphaproteobacteria)和β变形菌纲(Betaproteobacteria)，其中α变形菌纲丰度较高。优势菌群固氮螺菌属(Azospirillum)、中华根瘤菌属（Sinorhizobium）和中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium），在埋置白三叶后丰度都增加，而慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）的丰度降低。

目录

论文说明

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 黄土高原苹果园研究进震

1．1．1 苹果生产研究进展

1．1．2 生草埋置是黄土高原苹果园增肥的有效模式

1．2 果园生草研究进展

1．2．1 果园生草的作用

1．2．2 果园生草草种和生草模式

1．3 植物残体降解的研究

1．4 土壤氮循环微生物的研究

1．4．1 土壤氮循环的研究

1．4．2 土壤硝化反硝化微生物多样性的研究进展

1．5 微生物多样性的研究方法

1．5．1 实时定量PCR

1．5．2 限制性酶切多态性(T-RFLP)

1．5．3 高通量测序

1．6 选题目的与意义

1．7 研究内容

1．8 技术路线

第二章 埋置白三叶对苹果园土壤肥力的影响

2．1 材料与方法

2．1．4 土壤肥力的测定

2．1．5 数据处理

2．2．1 埋置白三叶对苹果园土壤有机质含量的影响

2．2．2 埋置白三叶对苹果园土壤含水量和pH的影响

2．2．3 埋置白三叶对苹果园土壤硝态氮和铵态氮的影响

2．2．4 埋置白三叶对苹果园士壤全量养分含量的影响

2．2．5 埋置白三叶对苹果园土壤速效养分含量的影响

2．3 讨论

2．3．1 埋置白三叶对土壤有机质含量的影响

2．3．2 埋置白三叶对土壤含水量及pH的影响

2．3．3 埋置白兰叶对土壤N、P、K含量的影响

第三章 埋置白三叶对苹果园土壤硝化反硝化微生物丰度的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 试验地点概况

3．1．2 试验设计

3．1．3 土壤样品采集

3．1．4 土壤总DNA提取

3．1．5 qPCR方法测定硝化和反硝化细菌的丰度

3．1．6 数据分析

3．2 结果与分析

3．2．1 埋置自三叶对氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)丰度的影响

3．2．2 埋置白三叶对反硝化微生物丰度的影响

3．2．3 土壤肥力因子与硝化反硝化微生物丰度的关系

3．3 讨论

3．3．1 白三叶埋置对苹果园土壤硝化微生物丰度的影响

3．3．2 白三叶埋置对苹果园土壤反硝化微生物丰度的影响

3．3．3 硝化反硝化菌丰度与硝化反硝化作用的关系

第四章 埋置白三叶对苹果园土壤硝化反硝化微生物群落结构的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 试验地点概况

4．1．2 试验设计

4．1．3 土壤样品采集

4．1．4 土壤总DNA提取

4．1．5 T-RFLP方法测定硝化和反硝化细菌的群落结构

4．1．6 数据分析

4．2 结果与分析

4．2．1 埋置白三叶对氨氧化细菌和氨氧化古菌群落结构的影响

4．2．2 埋置白三叶对反硝化微生物群落结构的影响

4．2．3 埋置白三叶对硝化反硝化微生物多样性指数的影响

4．2．4 土壤肥力与硝化反硝化微生物群落结构的关系

4．3 讨论

4．3．1 埋置白三叶对硝化反硝化菌群落多样性的影响

4．3．2 埋置白三叶后土壤肥力因子的变化影响硝化菌的群落组成

4．3．3 埋置白三叶后土壤肥力因子的变化影响反硝化菌群落组成

第五章 埋置白三叶对苹果园土壤硝化反硝化微生物物种多样性的影响

5．1．5 高通量测序

5．1．6 数据分析

5．2 结果与分析

5．2．1 硝化和反硝化微生物测序结果及测序深度验证

5．2．2 硝化和反硝化微生物群落多样性和丰富度分析

5．2．3 硝化和反硝化微生物群落物种丰度与结构分析

5．3 讨论

5．3．1 硝化作用微生物菌群的变化

5．3．2 反硝化作用微生物菌群的变化

6．1 结论

6．2 创新点

6．3 研究展望

参考文献

致谢

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