细丽外担菌感染油茶的形态特征和转录组学研究

摘要

油茶（Camellia oleifera Abel.）是原产中国的独特油料树种，广泛用于化工、轻工、食品、饲料等行业，具有重要的经济价值。但是，随着自然生态环境的变化，油茶的病害逐趋严重，严重影响了油茶的利用价值。油茶叶肿病是由细丽外担菌(Exobasidium gracile(Shirai)Syd)侵染油茶幼芽和幼叶引起的真菌性病害，已经严重影响到油茶的种植和生产。深入研究油茶与细丽外担菌的互作过程、分析油茶对病原菌的抗病机制，发掘抗病基因，将为更好地油茶育种提供理论依据。
　　本研究将植物病理学研究和转录组测序技术有机结合，采用扫描电镜和透射电镜对油茶变态叶的形态结构和超微结构进行了观察，分析油茶叶肿病的组织病理学特征，同时通过转录组测序技术研究感病油茶叶片和健康油茶叶片的基因表达情况，筛选出抗病相关的差异表达基因，确定参与油茶病变过程中的关键要素，为进一步开展油茶病变相关的基因克隆和功能验证提供了丰富的基因资源。本研究得到的主要结果有:
　　(1)油茶叶肿病会导致油茶幼叶组织增生变成变态叶。通过扫描电镜观察发现，变态叶的叶片厚度比正常叶片厚度增加3～5倍，细胞体积增大3～8倍，细胞数增加1～2倍，同时叶片中栅栏组织和海绵组织消失而出现较大的薄壁细胞。
　　(2)叶片受细丽外担菌感染后，菌丝存在于下表皮向内的4～7层细胞间隙中，随着菌丝快速生长将其两侧的细胞逐渐分开，到感染后期叶片下表面脱落露出厚度为50～150μm的细丽外担菌白色子实层。
　　(3)通过透射电镜对叶片细胞超微结构的观察，发现在变态叶的病健交界部位，细胞质分布不均匀，细胞器开始出现变形;随着叶片感病程度加重，细胞中叶绿体双膜结构破坏，基粒减少甚至消失，同时也出现包括线粒体等其它亚细胞器被破坏的异常现象，只在靠近细胞壁的周围存在一些小的碎片和囊泡结构。
　　(4)高通量转录组测序共产生了35.44Gb clean data，获得315771条transcripts，筛选得到143014条Unigene序列。通过对6个样品的基因差异表达水平进行分析，共得到2834条差异表达基因，1160条上调，1674条下调。通过GO功能显著性富集分析和KEGG代谢通路分析，参与DNA复制、细胞循环、DNA或染色体构象等的细胞组分及生物学过程的基因显著上调，这与叶肿病导致的叶片细胞增殖相一致。同时，参与形成植物抗病屏障有关的苯丙素类化合物和谷胱甘肽的合成以及细胞色素P450代谢等差异表达基因的上调可能与细丽外担菌的感染过程中油茶叶片的防御反应激活密切相关。
　　总体来说，我们的初步研究成功鉴定出一系列可能与油茶疾病抗性相关的差异表达基因，为进一步寻找油茶对于细丽外担菌抗性育种相关的早期的生物学标记提供了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 油茶简介

1．1．1 油茶的价值

1．1．2 油茶的种植现况

1．2 油茶病害

1．2．1 油茶叶肿病的发病特征

1．2．2 油茶叶肿病病原菌

1．2．3 油茶叶肿病的研究进展

1．3 转录组学研究概况

1．3．1 转录组研究方法

1．3．2 转录组测序的应用

1．4 研究的目的和意义

第二章 油茶叶肿病的形态特征

2．1 试验材料

2．1．1 油茶叶片来源

2．1．2 主要试剂

2．2 试验方法

2．2．2 扫描电镜样品的制备与观察

2．2．3 超微结构的观察

2．3 结果与分析

2．3．1 变态叶的外部形态特征

2．3．2 变态叶片的冷冻切片观察

2．3．3 油茶叶肿病的扫描电镜观察

2．3．4 变态叶的超微结构特征

2．4 结论与讨论

第三章 细丽外担菌侵染油茶的转录组分析

3．1 试验材料与仪器

3．1．1 油茶叶片

3．1．2 试验仪器

3．2 试验方法

3．2．1 总RNA提取与检测

3．2．2 转录组文库构建及测序

3．2．3 测序数据质量评估

3．2．4 转录本拼接

3．2．5 基因功能注释

3．2．6 CDS预测

3．2．7 SNP、InDel及SSR分析

3．2．8 基因表达水平分析

3．2．1 1实时定量PCR验证

3．3 结果与分析

3．3．1 测序数据质量分析

3．3．2 转录本拼接结果统计

3．3．3 基因功能注释

3．3．4 CDS预测

3．3．5 SNP、InDel和SSR分析

3．3．6 基因表达分析

3．3．7 差异表达分析

3．3．8 差异表达基因的qRT-PCR验证

3．4 结论与讨论

3．4．1 物理防御途径

3．4．2 化学防御途径

第四章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介