根癌农杆菌介导须癣毛癣菌ZafA基因的遗传转化

摘要

须癣毛癣菌是一种重要的人畜共患皮肤癣菌，主要感染人与动物的皮肤角质层及其附属角质化组织。锌是微生物重要的必需微量金属元素之一，是细胞中的第二大过渡金属，对病原微生物的生长、繁殖、致病力具有重要作用。目前已在多种真菌中发现参与调控真菌细胞锌离子稳态的相关基因，其中锌离子反应转录激活因子基因（ZafA）表达蛋白及其同源蛋白已被证明在病原性真菌胞内锌稳态调控和致病力中具有重要作用。通过转录组测序已在须癣毛癣菌中发现ZafA基因，但该基因及其表达的蛋白功能目前仍不清楚。根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)是目前真菌基因敲除的常用方法之一，已经成功应用于多种丝状真菌的遗传转化。本文利用ATMT法对须癣毛癣菌ZafA基因进行遗传转化，构建ZafA基因转化株，并对须癣毛癣菌ATMT转化体系进行优化，为后续ZafA功能验证奠定基础。试验结果如下:
　　1、将构建完成的含有ZafA基因同源片段及潮霉素抗性标记基因的双元载体pDHt/ZafA-ⅠⅡ∷hph转入根癌农杆菌中，PCR验证转化成功后，利用带有双元载体的根癌农杆菌介导转化须癣毛癣菌分生孢子，PCR验证结果证明须癣毛癣菌ZafA基因成功地被hph基因替代实现转化。
　　2、在转化过程中使用不同的固相载体（Hybond N+尼龙膜、PVDF膜、滤纸），不同共培养时间(36h、48 h、60h)，预培养中是否加入AS，在28℃共培养条件下对转化体系进行优化。发现预培养中加入AS获得的转化株数量显著高于未加AS组，使用Hybond N+尼龙膜、滤纸均可获得转化株，且差异不显著，使用PVDF膜时无转化株出现。在28℃共培养条件下，将共孵育时间延伸至60h，可显著提高转化效率。
　　综上所述，通过ATMT体系可成功转化须癣毛癣菌ZafA基因，获得须癣毛癣菌ZafA基因转化株。根癌农杆菌在经AS诱导培养后与须癣毛癣菌分生孢子液(1×107 CFU/mL)1∶1混合，涂布于覆盖尼龙膜或滤纸的共培养基中，28℃共培养60 h可获得较高数量的转化子。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 皮肤癣菌病及皮肤癣菌

1．2 须癣毛癣菌

1．2．1 须癣毛癣菌生物学特征

1．2．2 临床特征及流行病学

1．2．3 发病机制及致病因子

1．2．4 宿主免疫机制

1．3 锌反应转录激活因子研究

1．3．1 真菌体内锌离子作用

1．3．2 真菌锌摄取机制研究

1．3．3 ZafA蛋白及其同系物

1．4 根癌农杆菌介导的遗传转化

1．5 小结

第二章 根癌农杆菌介导须癣毛癣菌ZafA基因的遗传转化

2．1 材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要试剂配制

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 双元载体的转化

2．2．2 双元载体的转化鉴定

2．2．3 根癌农杆菌介导须癣毛癣菌ZafA基因的遗传转化

2．2．4 须癣毛癣菌转化株鉴定

2．3 结果

2．3．1 双元质粒pDHt／ZafA-ⅠⅡ::hph转化验证

2．3．2 ATMT转化结果初步鉴定

2．3．3 ATMT介导须癣毛癣菌转化体系优化

2．3．4 转化株鉴定结果

2．4 讨论

2．4．1 须癣毛癣菌遗传转化系统的选择

2．4．2 ATMT介导须癣毛癣菌转化体系的优化

2．4．3 须癣毛癣菌ATMT转化同源重组效率

2．4．4 本研究存在问题及后续研究方向

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介