马立克病毒感染后鸡脾脏转录组学及miR-M4-5p调控马立克病毒致病机理的研究

摘要

马立克病（Marek’s Disease，MD）是由马立克病毒（Marek’s disease virus，MDV）引起的严重危害世界家禽养殖业的疾病，该病主要临床症状为被感染鸡只麻痹、眼盲、淋巴瘤形成以及免疫抑制。MDV属于疱疹病毒目、疱疹病毒科、疱疹病毒甲亚科、马立克病毒属的双链线性DNA病毒。MD是最早能够用抗病毒疫苗防治病毒诱导的肿瘤病，是研究病毒诱导肿瘤的重要模型。近年来，MDV毒力的不断增强，免疫失败的例子时常发生，而且毒力的进化很可能由疫苗本身驱动。高毒力MDV毒株引起的MD爆发可能是家禽养殖业的巨大威胁。
　　MicroRNA是内源性的、长度约20-24碱基的非编码RNA，它们通过后转录机制调节基因表达及细胞分化、发育、增殖和凋亡等多种生物过程。MDV1基因组编码26个成熟 microRNA，研究表明一些 microRNA在 MDV1致病过程发挥重要作用，其中miR-M4-5p是miR-155的病毒模拟物。研究发现miR-M4-5p可能直接参与MD淋巴瘤形成。因此，对miR-M4-5p调控MDV致病机理的研究有助于加深对MD分子机制，尤其是肿瘤发生机制的理解。
　　1、MDV超强毒株GX0101感染后鸡脾脏动态转录组的研究
　　为了解MDV感染后宿主基因的动态变化，本研究以MDV超强毒株GX0101感染后3、7、14、21、30和60天的脾脏为研究对象。提取实验组及对照组脾脏样品RNA并进行质量检测，结果显示RNA样品质量符合RNA-seq建库要求，能够用于转录组测序。RNA-seq完成后，对原始数据进行数据过滤后获得高质量数据；各个文库89％以上的clean reads能比对到参考基因组上。对基因表达量进行分析，在GX0101感染后3、7、14、21、30和60天分别获得1,567、1,342、2,503、3,517、3,810和1,351个差异表达基因，其中上调基因分别有736、812、1,507、2,250、2,390和571个；下调基因分别有831、530、996、1,267、1,420和780个。12个宿主基因qRT-PCR检测结果与RNA-seq结果一致，进一步证明RNA测序结果的真实性和可靠性。差异基因功能分析发现：先天免疫反应和炎症反应在早期溶细胞期建立，持续到淋巴瘤形成阶段；体液免疫在后期溶细胞期，且最先在肠道系统中发挥作用；在细胞增殖阶段，与转录和翻译相关的信号通路被显著富集。本研究为进一步了解马立克病发病机理提供了数据支撑；同时，分析获得的GX0101感染导致的下调基因为miR-M4-5p提供了候选基因库。
　　2、miR-M4-5p靶向hnRNPAB促进CEF和DF-1细胞的增殖
　　在本研究中，利用生物信息学软件对测序获得的下调基因库基因进行预测，筛选获得7个miR-M4-5p的假定靶标，分别为早期生长反应蛋白1（EGR1）、结缔组织生长因子（CTGF）、纤维连接蛋白1（FN1）、免疫球蛋白 J链（IGJ）、核不均一核糖核蛋白AB（hnRNPAB）、蛋白酪氨酸磷酸酶5（PTPN5）和胶原蛋白XII型（COL12A）。利用双荧光素酶报告实验检测miR-M4-5p对各基因的抑制效果，结果发现hnRNPAB-3’UTR荧光素酶活性被抑制，且抑制效应具有靶标位点以及种子序列特异性。在过表达miR-M4-5p或GX0101感染的CEF细胞中，qRT-PCR和Western blot检测结果均发现hnRNPAB表达量被降低，证明hnRNPAB是miR-M4-5p的靶标。为研究miR-M4-5p和hnRNPAB对细胞功能的影响，过表达miR-M4-5p或特异性沉默hnRNPAB表达，结果发现 CEF和 DF-1细胞的细胞活性增强，细胞凋亡不受影响。本研究阐明 miR-M4-5p靶向hnRNPAB调控细胞增殖是调控肿瘤的方式之一。
　　3、鸡hnRNPAB单克隆抗体的制备及应用
　　由于商品化hnRNPAB多克隆或单克隆抗体不能识别鸡hnRNPAB蛋白，hnRNPAB蛋白水平的研究被限制，因此，需要自制鸡 hnRNPAB抗体。构建的三种重组蛋白pET28a-hnRNPAB、pET30a-hnRNPAB和pET32a-hnRNPAB均正常表达，且都引起小鼠的免疫反应。其中，pET30a-hnRNPAB蛋白以可溶状态表达，并且该蛋白的小鼠免疫效果最好。经融合、鉴定筛选获得单克隆抗体5H5-H1和5H5-G2，它们的效价为8.19×105。Western blot结果证实其均能特异性结合鸡hnRNPAB蛋白。同时，制备的单克隆抗体还能用于多种哺乳动物源 hnRNPAB蛋白的免疫荧光检测实验。本研究为进一步研究鸡hnRNPAB蛋白生物学功能提供了必备材料。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 马立克病毒的研究进展

1.2 MDV感染后宿主基因表达谱研究进展

1.3 病毒编码microRNA的研究进展

1.4 本研究的目的与意义

第二章 MDV感染鸡脾脏组织转录组研究

2.1 前言

2.2 材料

2.3 方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

2.6 小结

第三章 miR-M4-5p靶向hnRNPAB促进CEF和DF-1细胞的增殖

3.1 前言

3.2 材料

3.3 方法

3.4 结果与分析

3.5 讨论

3.6 小结

第四章 鸡hnRNPAB蛋白单克隆抗体的制备

4.1 前言

4.2 材料

4.3 方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论

4.6 小结

全文总结与创新点

全文总结

创新点

参考文献

附录

致谢

作者简介