野生二粒小麦优异耐盐种质的鉴定及其相关基因的发掘

摘要

野生二粒小麦(Triticum dicoccoides)是六倍体普通小麦AB基因组的供体，具有粒大、穗长、抗病、耐逆等优良特性。作为小麦重要的基因库，野生二粒小麦在普通小麦产量、品质以及抗逆遗传改良方面具有重要的利用价值。MicroRNAs (miRNAs)是植物体内一种内源小分子量非编码 RNA，作为转录后调节因子，能够调节许多分子和生化过程。转录组测序（RNA-seq）方法能够大规模鉴定植物逆境胁迫相关基因，解析其表达模式。随着高通量测序技术的发展和生物信息分析方法的进步，作物的全基因组测序不断完善，比较基因组学分析有助于揭示基因的进化速率和结构特征。本研究在系统鉴定、发掘野生二粒小麦优异耐盐种质的基础上，利用高通量测序技术高效、快速挖掘和鉴定其盐胁迫相关基因及 miRNA，并结合生理生化性状指标，比较耐盐品系和盐敏感品系在转录水平的表达和调控模式，并结合野生和栽培二粒小麦的比较基因组学分析，初步揭示了野生二粒小麦响应盐胁迫的分子机制。主要的研究结果如下： （1）为了系统评估野生二粒小麦对盐胁迫的耐受性，我们选取了30份代表性野生二粒小麦以及 14 份硬粒小麦为材料，对其抗盐性进行了系统评估。将这些材料进行长期盐胁迫后（30天），对其在正常条件下和盐胁迫情况下的形态性状、光合特性、生理特性以及K+, Na+离子浓度等，共30个性状指标进行了系统测定及评估。利用多元线性回归拟合了每个品系的耐盐胁迫指数（STI）, 筛选出了5份高耐盐型野生二粒小麦种质材料，为普通小麦耐盐性改良提供了重要种质。比较分析发现，野生二粒小麦在各个性状的变异度均显著高于硬粒小麦，说明野生材料的遗传多样性较高；在所测定的指标中，植株地上部分Na+含量、地上部分K+/Na+含量比值、根长、根表面积被证实可作为合适的耐盐筛选评价指标；通过比较盐胁迫和正常条件下的地上部和地下部K+/Na+含量，发现Na+排出机制可能是二粒小麦响应盐胁迫的重要方式。 （2）为了鉴定、发掘野生二粒小麦盐胁迫相关的miRNA，利用高通量测序技术对耐盐品系（GilbourB5）在盐胁迫和正常条件下的小RNA表达谱进行了分析。共鉴定到88个保守miRNA和124个新的miRNA。差异表达分析发现50个miRNA在盐胁迫下表达差异显著，32个上调表达，18个下调表达；其中，Ttd-miR172b、Ttd-miR1120a和Ttd-mi393a差异表达最显著，可能在盐胁迫响应中发挥了重要的作用。在此基础上，利用psRNATarget工具对这些miRNA的靶基因进行了预测，共鉴定到1638个靶基因，富集分析发现其功能集中于转录因子以及抗逆代谢物生物合成。通过比较分析野生二粒小麦及其近缘种在盐胁迫和旱胁迫响应的 miRNA 的表达模式，发现 miR156、miR171、miR396 等在所列小麦属物种都为盐、旱胁迫响应 miRNA，而 miR1432，miR474 存在物种特异性，只在野生二粒小麦特异表达。最后，利用RT-PCR研究了7个耐盐胁迫相关miRNA在盐敏感品系和耐盐品系中不同盐处理时间（0 h，3 h，6 h，12 h，24 h）和不同盐处理浓度（150 mM，250 mM）的表达谱，发现这些miRNA在不同品系、不同盐处理和不同胁迫时间的表达模式变化较大。本研究不仅丰富了野生二粒小麦 miRNA的数据资源，并且为解析小麦miRNA参与盐胁迫应答的分子机制奠定了基础。 （3）利用转录组测序（RNA-seq）对耐盐品系（GilbourB5）和盐敏感品系（GilbourA9）在盐胁迫和正常条件下的基因表达谱进行分析。从耐盐品系中鉴定到 83 个差异表达基因，在盐敏感品系中鉴定到了1618个差异表达基因，其中，两者共有的差异基因为36个，这些可能是野生二粒小麦盐胁迫响应相关的关键候选基因。功能富集分析发现，这些差异基因主要参与氧化应激反应（response to oxidative stress, GO: 0006979）、PSII的捕光复合物II相关的代谢过程（PSII associated light-harvesting complex IIcatabolic process, GO: 0010304）和叶绿素的分解过程（chlorophyll catabolic process, GO: 0015996）；进一步结合基因数目、表达模式、基因功能多样性、生理生化特征分析，发现盐敏感品系的基因表达倍数、根系性状、光合性状、氧化应激反应等更容易受盐胁迫的影响，且变化差异大于较耐盐品系。基于转录组数据对响应盐胁迫的RNA编辑和选择性剪接事件进行了分析，在耐盐品系和盐敏感品系中分别鉴定到 738 个和 778 个响应盐胁迫的RNA编辑位点，290个和670个选择性剪接事件。以上研究揭示了野生二粒小麦响应盐胁迫的转录表达和转录后调控模式，为进一步开展相关研究提供了重要参考。 （4）根据最新发布的野生二粒小麦及相关近缘物种的参考基因组信息，运用比较基因组学分析方法，对其中受正选择基因进行了鉴定和分析。结果发现，在野生二粒小麦A、B基因组之间、野生二粒小麦A基因组和硬粒小麦A基因组、野生二粒小麦B基因组和硬粒小麦B 基因组以及野生二粒小麦 A基因组和乌拉尔图小麦基因组之间鉴定到的正选择基因（PSG）分别为439个、619个、654个和1407个。进一步比较发现PSG（正选择基因）相对于NSG（负选择基因）具有较高的非同义核酸替代率和较低的同义核酸替代率，较短的基因、编码序列、外显子/内含子长度，较低的基因表达水平和较低的密码子偏好性，较高的组织表达特异性，且具有不同的功能分化，说明 PSG 基因和 NSG 基因不仅在选择压力上存在明显差异，在进化速率基因结构特征、表达特性和功能分类上也具有明显差异。同时，各个组分之间由于分化时间和进化速率的不同，各性状的表现趋势和状态也有所不同：野生二粒小麦亚基因组A、B之间的进化速率和结构特征的差异相对较高；野生二粒小麦和硬粒小麦A、B相对于各自对应的亚基因组没有显著差别，各结构特征和性状数据差别低于其它两个分组。以上研究为大规模比较基因组分析提供了参照，为了解野生二粒小麦及其近缘物种的进化历程提供了新的视角。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 野生二粒小麦及其耐盐性

1.2 高通量测序与麦类基因组

1.3 植物转录组学研究

1.4 植物miRNA组学研究

1.5 研究目的及意义

第二章 野生二粒小麦耐盐性评价与筛选

2.1材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 野生二粒小麦盐胁迫相关miRNA的鉴定及比较分析

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 野生二粒小麦盐胁迫相关基因的发掘与鉴定

4.1 材料与方法

4.2 结果与讨论

4.3 小结

第五章 野生二粒小麦的比较基因组学分析

5.1 材料与方法

5.2 结果与讨论

5.3 小结

第六章 结论

参考文献

附录

致谢

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