华山松大小蠹化学感受蛋白和味觉受体基因功能研究

摘要

华山松大小蠹（DendroctonusarmandiTsai and Li）是我国重要的针叶林害虫，造成巨大的经济损失和严重的生态破坏。华山松大小蠹除迁飞成虫短暂的扩散期以寻找新的寄主植物和配偶外，其它所有虫态都生活在华山松韧皮部，具有很强的隐藏性，防治困难。华山松大小蠹利用聚集信息素调节对寄主树木的大量入侵，而其对信息素的反应又受到寄主和非寄主树木释放的气味调节，华山松大小蠹对寄主和非寄主挥发物以及昆虫信息素都有强烈的电生理响应，灵敏的化学感受系统在华山松大小蠹觅食、交配、寻找产卵地、回避毒素、逃离天敌追踪中起着重要作用，对华山松大小蠹化学感受蛋白（CSPs）和味觉受体（GRs）基因的鉴定及功能解析有助于探索华山松大小蠹化学感受的分子机制，也可为利用信息素调节华山松大小蠹的种群密度和发生范围提供理论依据。本研究通过对华山松大小蠹CSPs和GRs基因的系统发育、华山松大小蠹CSPs和GRs基因在不同发育阶段和组织表达差异、华山松大小蠹CSPs和GRs基因在取食和饥饿诱导下的表达差异、华山松大小蠹 CSPs 结合特性、RNA 干扰 CSP基因对华山松大小蠹触角电生理响应的影响，揭示华山松大小蠹 CSPs和GRs 在识别寄主植物挥发物和信息素中的作用机制，研究取得以下成果： 1. 通过RT-PCR和RACE技术获得9条华山松大小蠹CSPs基因的全长序列。华山松大小蠹 CSPs基因氨基酸序列与其它小蠹虫有很高相似度，为同源基因，可能具有相似的表达谱和功能。且9条华山松大小蠹CSPs基因自身相似度很低，说明具有多种功能。 2. 华山松大小蠹 CSPs 基因在不同发育时期和组织中呈现出不同的表达模式。DarmCSP4、DarmCSP5和 DarmCSP6在老熟幼虫和蛹中的表达量显著高于其它阶段， DarmCSP2和DarmCSP9 在羽化之前上调，说明这 5 个基因参与了华山松大小蠹的变态。DarmCSP1、DarmCSP3、DarmCSP7和DarmCSP8 在成虫期相对表达量高于其它阶段，说明与华山松大小蠹成虫特异性化学感受行为（寻找新的寄主和求偶）有关。DarmCSP1、DarmCSP2、DarmCSP3和DarmCSP7 在触角中的相对表达量较其它组织高，其中 DarmCSP3 在触角中特异表达，说明 DarmCSPs 基因可能在嗅觉中起作用，主要参与识别挥发性的化合物（性信息素和植物寄主挥发物）。而 DarmCSP2、DarmCSP4、DarmCSP5、DarmCSP8和DarmCSP9 基因在口器中的表达量高于其它组织，说明该基因可能在味觉中起作用，主要功能与识别食物中的非挥发性物质或近距离检测气味分子有关。总之，在不同发育阶段和组织的表达谱表明华山松大小蠹 CSPs基因可能参与调控发育、嗅觉和味觉感受等多种功能。 3. 华山松大小蠹的 CSPs 基因在迁飞成虫的取食和饥饿处理中呈现多样的表达模式。DarmCSPs 基因的相对表达量在不同的取食阶段呈现出下调（DarmCSP1和DarmCSP2雌雄虫）或先下调后上调（DarmCSP3和DarmCSP6雌雄虫和DarmCSP4雄虫）的趋势，表明这些 CSPs基因在华山松大小蠹取食时相互协调，一起调节气味分子的转运。同时DarmCSP8（雌雄虫）和DarmCSP4（雌虫）在取食阶段呈现上调趋势，表明可能与识别和运输寄主植物非挥发性次生代谢物有关。在饥饿处理中雌雄华山松大小蠹的DarmCSP2、DarmCSP8和DarmCSP9基因的相对表达量上调，且上调时间不一样，说明它们相互协调共同参与寄主的寻找。 4. 荧光竞争试验结果表明DarmCSP2和DarmCSP9与选出的10种寄主挥发物和4种信息素都有强的亲和力，并且 DarmCSP2 对所有物质的亲和力都比 DarmCSP9 强，表明这两种蛋白质既能与寄主挥发物结合又能与华山松大小蠹的信息素结合，在华山松大小蠹的化学感受中发挥了重要的作用。在 DarmCSP2的3D模型中，DarmCSP2的I73和W80残基与SgerCSP4中信息素结合的关键活性位点I76和W83相对应，表明这两个位点在信息素结合中发挥重要作用。 5.对华山松大小蠹迁飞成虫进行RNAi，结果表明干扰后DarmCSP2的相对表达量显著降低，并且华山松大小蠹的触角对 6 种寄主挥发物（(+)-α-Pinene、(+)-β-Pinene、(-)-β-Pinene、(+)-Camphene、(+)-3-Carene和Myrcene） 的电生理反应也显著降低，但是对其它寄主挥发物和信息素的电生理反应没有变化。表明 DarmCSP2 可能在华山松大小蠹的嗅觉上起关键作用，并且 DarmCSP2 与多种载体蛋白（包括其它 CSPs和OBPs）共同合作运输大量的化合物。 6. 通过RT-PCR和RACE技术获得了1条华山松大小蠹GRs基因的全长序列。经与其它昆虫的氨基酸序列比对和系统发育分析，可以确定获得的GR属于CO2 GR，并且与果蝇的DmelGR63a和其它昆虫的GR3同源，因此命名为DarmGR3。DarmGR3在迁飞成虫和新入侵成虫中表达量显著高于其它阶段，并且在迁飞成虫触角中的表达显著显著高于其它组织，说明其在华山松大小蠹寻找新寄主、配偶和产卵位置中等活动中发挥作用。在饥饿72 h后，雌雄迁飞成虫中DarmGR3相对表达量都显著上调，也说明其可能参与了寻找寄主植物。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 昆虫的化学感受系统

1.2 化学感受蛋白的研究进展

1.3 味觉受体的研究进展

1.4 小蠹虫研究进展

1.5 研究目的意义与研究内容

第二章 华山松大小蠹CSPs基因的克隆与序列分析

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论与小结

第三章 华山松大小蠹CSPs基因的表达谱分析及诱导表达

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论与小结

第四章 华山松大小蠹CSPs的表达纯化及其结合特性

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 讨论与小结

第五章 华山松大小蠹CSPs基因的RNA干扰

5.1 材料与方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论与小结

第六章 华山松大小蠹GR基因的克隆及表达谱分析

6.1 材料与方法

6.2 结果与分析

6.3 讨论与小结

第七章 结论与展望

7.1 结论

7.2 创新

7.3 展望

参考文献

略缩词

致谢

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