西农萨能奶山羊乳腺α-S1-酪蛋白基因功能的初步研究

摘要

αs1-酪蛋白（Alpha S1Casein,CSN1S1）是乳蛋白中一种重要的蛋白质，可以为动物体的生长发育提供活性肽、必需氨基酸等营养物质，也能够调节乳腺上皮细胞等多种细胞的生理状态及功能。因此，探究αs1-酪蛋白基因对奶山羊乳蛋白合成的调控作用有极其重要的意义。本研究通过克隆得到奶山羊CSN1S1基因的CDS区，并构建了CSN1S1基因重组腺病毒过表达载体，同时在线设计并合成靶向CSN1S1基因的特异性siRNA。在山羊乳腺上皮细胞中分别对CSN1S1基因进行过表达和干扰，通过RT-qPCR和Western Blot等方法检测乳蛋白相关基因表达量及部分乳蛋白表达量的变化，为进一步明确αs1-酪蛋白基因在乳蛋白合成中的功能奠定一定的理论基础。以下为本研究主要结果： 1.采集泌乳盛期西农萨能奶山羊乳腺组织，提取总RNA，根据GenBank中收录的Capra hircus的CSN1S1基因序列（KT253650.1）来设计引物，利用RT-PCR技术克隆得到山羊CSN1S1基因CDS序列，其长度为642bp，编码213个氨基酸。生物信息学分析得出，山羊CSN1S1基因CDS区序列与Ovis aries（FJ440845.1）、Bos taurus（EU908730.1）、Mus musculus（AF275367.1）、Sus scrofa（NM_001004029.2）、Homo sapiens（NM_001890.2）的同源性分别为：98.91%、97.83%、84.87%、92.52%以及85.69%。 2.构建含目的基因的同源重组质粒pAdEasy-CSN1S1，转染293A细胞，感染扩增四代得到高滴度腺病毒，滴度为108U/mL。通过不同体积的病毒液感染山羊乳腺上皮细胞，确定病毒最佳感染复数（MOI）为200。病毒感染山羊乳腺上皮细胞48h后收集细胞总RNA或总蛋白，RT-qPCR结果显示，CSN1S1基因表达量显著上调（P<0.01），CSN2基因表达显著下调（P<0.05），CSN1S2、CSN3、LALBA、BLG的表达水平无显著变化；Western blot结果显示，过表达CSN1S1基因后，αs1-酪蛋白表达量显著升高（P<0.05），β-酪蛋白表达量显著下降（P<0.05），αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白及β-乳球蛋白表达水平无显著变化。 3.根据CSN1S1基因CDS区序列，设计靶向CSN1S1基因的特异性siRNA，并转染山羊乳腺上皮细胞，筛选得到干扰效率最佳的siR-507（P<0.01）。干扰CSN1S1基因后，RT-qPCR结果显示，CSN2基因表达水平显著上调（P<0.05），CSN1S2、CSN3、LALBA、BLG基因的mRNA水平无显著变化；Western blot结果显示，αs1-酪蛋白表达量被抑制（P<0.05）；β-酪蛋白表达水平显著上调（P<0.05），αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白及β-乳球蛋白的表达无明显变化。 综上所述，本研究成功克隆得到了奶山羊αs1-酪蛋白基因的CDS区，构建了腺病毒过表达载体，并感染山羊乳腺上皮细胞以过表达CSN1S1基因，可导致CSN2基因的mRNA表达水平及蛋白表达显著下调，干扰αs1-酪蛋白基因能够显著上调CSN2基因及β-酪蛋白表达。本研究为明确CSN1S1基因在西农萨能奶山羊乳腺细胞乳蛋白合成中的调控作用提供理论依据。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1乳腺发育及泌乳过程

1.2 羊乳营养价值和成分分析

1.3 乳蛋白研究进展

1.4 酪蛋白研究进展

1.5 本研究的目的与意义

第二章 奶山羊乳腺α-S1-酪蛋白基因（CSN1S1）的克隆及生物信息学分析

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 奶山羊乳腺CSN1S1基因过表达对乳蛋白相关基因表达的影响

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 奶山羊乳腺CSN1S1基因干扰对乳蛋白相关基因的影响

4.1 材料和方法

4.2 结果和分析

4.3 讨论

4.4 小结

结论

创新点

参考文献

附录

致谢

作者简介