细胞穿膜肽TAT介导猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体Nb6抗病毒感染的研究

摘要

猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）是一种以猪繁殖障碍和呼吸疾病为特征的病毒性传染病，是目前造成全球养猪业巨大经济损失的重要传染病之一。该病由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起。PRR SV以高变性、免疫抑制、持续性感染及抗体依赖性增强为特征，现有疫苗的群体保护力较低，尚无有效的抗病毒药物。PRRSV非结构蛋白Nsp9是RNA依赖的RNA聚合酶，在不同毒株间高度保守，被认为是抗PRRSV药物的一个重要靶标。在先前的研究中，本实验室成功制备出一株PRRSV Nsp9特异性纳米抗体Nb6，并且证明细胞内表达的Nb6可以显著抑制PRRSV在M ARC-145细胞中的复制。然而，由于纳米抗体不能有效穿过细胞膜，因此不能进入细胞达到抗病毒的作用。因此，制备安全、有效和无细胞毒性的细胞内递送系统对于提高Nb6的抗病毒活性至关重要。 细胞穿透肽（cell penetrating peptides,CPPs）是一类含有约5-30个氨基酸的短肽，可以通过直接易位或内吞作用等方式进入细胞内，且不会引起细胞毒性。目前，CPPs已经被用作向细胞内递送各种货物的工具，例如质粒DNA，siRNA，蛋白质，病毒，成像剂和其他各种纳米颗粒等。TAT蛋白（HIV-1trans-activator）是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）反式激活因子，是最早被报道的CPPs。目前已有关于TAT与纳米抗体融合蛋白在癌症治疗中的研究报道，结果表明其具有显著的抗癌效果，并有望被开发为新型抗癌药物。然而，关于CPPs在PRRSV防控中的应用尚未有研究报道。 基于以上背景，本研究利用原核表达系统成功表达TAT-Nb6融合蛋白，对其穿膜及抗PRRSV功能进行验证，并对Nb6的抗病毒机制进行初步探索，为抗PRRSV纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。主要研究内容及结果如下： 1.细胞穿膜肽TAT介导纳米抗体穿膜的研究 本研究首先利用原核表达表达系统获得TAT-Nb6融合蛋白。通过Overlap PCR扩增获得TAT-Nb6基因片段，将其克隆至原核表达载体p ET-21b中，构建p ET-21b-TAT-Nb6重组表达质粒。该重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中，IPTG诱导后，获得以包涵体形式表达的TAT-N b6融合蛋白。经N i-NTA亲和层析柱纯化、复性和浓缩得到高纯度的TAT-Nb6，并通过ELISA方法验证了TAT-Nb6与PRRSV Nsp9重组蛋白具有很强的结合力。然后将TAT-Nb6分别加入到MARC-145细胞和PAMs细胞的培养基中，与细胞进行共孵育，并利用Western blot、间接免疫荧光和流式细胞术检测两种细胞内TAT-Nb6的量。实验结果表明，TAT能够介导纳米抗体Nb6进入两种细胞，并且呈时间和剂量依赖性。随后对细胞活性进行检测，发现TAT-Nb6浓度≤30μM时对两种细胞均没有细胞毒性。进一步验证了TAT-Nb6在猪体内的穿膜能力，免疫组织化学实验结果表明，TAT-Nb6在所有的收集的组织中都有分布。本部分研究结果表明，原核表达的TAT-Nb6融合蛋白不仅可以与PRRSV Nsp9重组蛋白发生互作，同时具有进入细胞的能力。 2.TAT-Nb6抗PRRSV的研究 本研究通过病毒感染实验来研究TAT-Nb6的抗PRRSV功能。结果表明，TAT-Nb6可以抑制PRRSV基因1型（GZ11-G1）与2型（SD16、JX-A1、GD-HD、VR-2332）毒株在M ARC-145细胞系或原代PAM细胞上的增殖，并且呈剂量依赖性。同时发现TAT-Nb6对PRRSV的抑制效果在不同毒株间存在差异。为了初步探索Nb6抗PRRSV的机制，利用酵母双杂交技术寻找Nb6与Nsp9的结合区域。结果表明，Nb6与Nsp9互作位点位于Nsp9羧基端的两个不连续区域：Nsp9aa454-551和Nsp9aa599-646。进一步对Nsp9aa454-646氨基酸同源性进行分析，结果发现基因1型不同毒株间同源性达到92.2%-100%，2型毒株间达到92.7%-100%，而两种基因型之间同源性只有77.7-81.3%。 综上所述，本研究成功表达了TAT-Nb6融合蛋白，该蛋白能够进入到PRRSV感染的细胞内，并发挥抗病毒作用，具有开发为抗PRRSV新型药物的潜力。同时对Nb6抗PRRSV的机制进行初步探索，为抗PRRSV纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。

目录

声明

主要符号对照表

第一章 文献综述

1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展

1.2 纳米抗体的研究进展

1.3 细胞穿膜肽研究进展

1.4 本研究目的与意义

第二章 细胞穿膜肽TAT介导纳米抗体Nb6穿膜的研究

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 TAT-Nb6抗PRRSV功能的研究

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

3.5 小结

全文总结

本研究创新点与下一步研究方向

创新点：

下一步研究方向：

参考文献

附录

致谢

作者简介