昌黎、银川产区酒酒球菌遗传多样性分析及优良菌株筛选

摘要

酒酒球菌（Oenococcus oeni，O.oeni）是苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）的主导菌，是葡萄酒最终质量风格的塑造者之一。法国、西班牙、意大利、澳大利亚、阿根廷和智利等发达的葡萄酒生产国非常重视对酒酒球菌进行遗传多样性的研究，进而开发利用本土优良酒酒球菌。而在中国不同葡萄酒产区，基于菌株水平进行的酒酒球菌遗传多样性及筛选本土优良发酵菌株等方面的研究，仍较为匮乏。 因此，本研究同时应用荧光标记扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术和基于看家基因建立的多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）技术，对分离自中国不同葡萄酒产区的酒酒球菌开展遗传多样性研究，并对其分型能力进行评估。选择更为高效的遗传分型技术，对具有中国“葡萄酒原产地保护区”的代表性产区——昌黎产区和宁夏银川产区，进行酒酒球菌的遗传分型及多样性分析；随后，建立三级筛选优良菌株体系：采用specific-PCR技术，通过功能基因鉴定，实现对分离本土酒酒球菌的快速、精准的初步筛选；经抗胁迫能力评估，得到复筛菌株；最后研究不同菌株的酿酒风格特色，从而筛选出适用于中国特色葡萄酒酿造的本土优良酒酒球菌。试验结果如下： （1）采用荧光标记AFLP技术和MLST技术，对分离自中国不同产区的38株酒酒球菌进行遗传多样性及其种群结构的研究。结果表明，荧光标记AFLP技术显示了强有力的遗传分型能力，得到37个AFLP型，其分辨系数高达99.9%；而采用MLST技术获得7个ST（sequence type，ST）型，其分辨系数仅为60.2%。在种群遗传结构分析上，荧光标记AFLP技术和MLST技术均可将试验菌株可以区分为2个亚种群结构，且种群结构成分相近。在MLST中，经生物信息学分析构建最小生成树（minimum spanning tree），发现这2个亚群呈现典型的克隆复合体结构；基于SplitsTree的重组分解分析，基因内及基因间不存在遗传物质的重组，进一步揭示了分离自中国不同产区的酒酒球菌是典型的克隆型种群结构特征。这些结果可以为中国本土酒酒球菌的遗传多样性分析提供理论依据及方法支持。 （2）采用Species-specific PCR及荧光标记AFLP技术，对中国首批“葡萄酒原产地保护区”昌黎产区不同酒庄的酒酒球菌进行分离鉴定及遗传多样性研究。结果表明：荧光标记AFLP技术可将222株O.oeni分为221个AFLP遗传型，其相似性系数在74～98%，表明该产区酒酒球菌遗传多样性丰富。基于非加权配对算术平均法(unweighted pair group method with arithmetic means，UPGMA)进行聚类分析，在81.7%的相似性水平上，分离菌株存在2个主要的结构类群。极其重要的是，在种群遗传发育上，分离自同一酒庄的O．oeni菌株种群形成了独特的簇群结构，呈现出种群遗传结构和分离来源的典型特异性关系。 （3）采用Species-specific PCR及荧光标记AFLP技术，对产自中国银川产区的赤霞珠葡萄酒和蛇龙珠葡萄酒中酒酒球菌进行分离鉴定及遗传多样性研究。结果表明：荧光标记AFLP技术可将筛选的207株O.oeni分为206个AFLP遗传型，其相似性系数在63～97%，表明该产区内酒酒球菌在菌株水平存在较高水平的遗传异质性。基于UPGMA进行聚类分析，在相似性系数为79.88%水平上，207株分离株呈现出清晰的A、B和C三个结构类群。其中，相似性水平为81%的A和B类群是最主要的结构类群；有趣的是，它们分离自不同的酿酒品种。这表明，在不同的酿酒葡萄品种上，蕴含着丰富的酒酒球菌微生物资源，且存在明显的种群结构差异。 （4）挑选分离自中国的本土酒酒球菌，采用specific-PCR技术，对分离菌株进行功能基因的鉴定，从而对具有潜在优良发酵特性菌株实现精准、快速地初步筛选。结果表明，挑选的170株酒酒球菌菌株均具有影响葡萄酒感官质量风格和抗胁迫相关的优良基因bgl、estA和gshR；与氨基甲酸乙酯生产紧密关联的arcABC基因簇中，均含有arcA基因，其中，发现13株arcB和arcC基因缺失型菌株；在生物胺相关主要功能基因检测中，合成腐胺和酪胺的功能基因均未发现；同时，检测到50株组胺合成缺失型菌株，这其中，含1株arcB和arcC基因缺失型菌株，它具有潜在高产氨基甲酸乙酯风险。因此，初步筛选到49株具有潜在优良发酵特性的本土酒酒球菌。 （5）对初筛菌株进行抗胁迫能力筛选，在9种不同胁迫条件的模拟酒中，以具有自主知识产权的优良菌株SD-2a为对照，通过显著性分析（P＜0.05），综合9种抗胁迫条件的表现，获得7株抗胁迫能力强的本土分离菌株：9-10、7-04、9-51、9-13、9-50、8-17和3-31。在葡萄酒发酵试验中，3-31和7-04同SD-2a一样，表现出极强的L-苹果酸代谢能力。通过GC-MS检测和主成分分析，不同菌株通过MLF，为马瑟兰葡萄酒带来了不同的发酵香气特征。其中，筛选的本土酒酒球菌优良菌株3-31，对马瑟兰葡萄酒整体发酵香气的影响最为显著，典型性强，且复杂浓郁馥美，对酿造中国特色的优质马瑟兰葡萄酒具有重要的生产应用价值。

目录

第一章 文献综述

1.1 酒酒球菌的分子遗传学研究

1.2 酒酒球菌胁迫机制研究

1.3 酒酒球菌发酵特性基因研究

1.4 酒酒球菌优良菌株的筛选研究

1.5 研究意义与内容

第二章 中国不同产区酒酒球菌的荧光标记AFLP分析和MLST分析

2.1 前言

2.2 材料与仪器

2.3 试验方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

2.6 小结

第三章 昌黎产区酒酒球菌的遗传多样性研究

3.1 前言

3.2 材料与仪器

3.3 试验方法

3.4 结果与分析

3.5 讨论

3.6 小结

第四章 银川产区酒酒球菌的遗传多样性研究

4.1 前言

4.2 材料与仪器

4.3 试验方法

4.4 结果与分析

4.5 讨论

4.6 小结

第五章 本土酒酒球菌优良菌株的specific-PCR定向筛选

5.1 前言

5.2 材料与仪器

5.3 试验方法

5.4 结果与分析

5.5 讨论

5.6 小结

第六章 本土酒酒球菌优良菌株的酿酒特性研究

6.1 前言

6.2 材料与仪器

6.3 试验方法

6.4 结果与分析

6.5 讨论

6.6 小结

第七章 结论、创新点和展望

7.1 主要结论

7.2 创新点

7.3 展望

参考文献

附录

致谢

个人简历