大肠杆菌属Nissle 1917胞外囊泡蛋白组分析及其对鼠巨噬细胞功能的免疫调控作用

摘要

大肠杆菌Nissle1917（EcN）是一种革兰氏阴性益生菌，因其对肠道疾病有显著的缓解效果而被广泛用于临床治疗中。它能够通过其分泌胞外囊泡调节宿主肠上皮细胞的免疫反应。巨噬细胞是固有免疫反应中的重要免疫细胞，然而关于EcN与巨噬细胞互作报道甚少。鉴于此，本试验旨在通过分离EcN的胞外囊泡（EcN_OMVs）探究其对巨噬细胞生物功能的调节作用，并利用蛋白组学技术进一步挖掘影响巨噬细胞功能的潜在免疫信号分子，为EcN在动物肠道中的免疫调节机制提供理论基础。试验包括两部分：（1）首先利用差速离心和梯度密度离心法分离和纯化EcN_OMVs，用激光纳米颗粒分析仪分析其粒径大小及分布，透射电子显微镜观察其形态结构；利用激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞对EcN_OMVs的内在化；用玻璃珠涂板法测定巨噬细胞吞噬病原性大肠杆菌的数量以探究EcN_OMVs对巨噬细胞杀菌能力的影响。然后分别用PBS（对照组）、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL和20μg/mL EcN_OMVs刺激RAW264.7巨噬细胞16h。检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和NO含量以及乳酸脱氢酶（LDH）活性，细胞裂解液中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）活性；（2）采用液相色谱-质谱联用技术分析EcN_OMVs蛋白组分；研究结果如下：（1）成功从EcN培养上清中分离纯化出具有磷脂双分子层结构的EcN_OMVs，其粒径范围是50～200nm，峰值为101.5nm； （2）EcN_OMVs能够被RAW264.7细胞所内化，且EcN_OMVs能够在5h后提高RAW264.7细胞的杀菌能力；与对照组相比，不同浓度EcN_OMVs处理的巨噬细胞的LDH活性没有显著差异（P＞0.05）；与对照组相比，各浓度EcN_OMVs处理的巨噬细胞分泌NO含量均显著提高（P＜0.05），其中，0.1μg/mL EcN_OMVs组NO含量显著低于其他三组；1μg/mL EcN_OMVs组iNOS活性显著高于对照组（P＜0.05）；与对照组相比，不同浓度的EcN_OMVs处理的细胞产生的炎症因子IL-6和IL-12均显著提高（P＜0.05）；1μg/mL和10μg/mL EcN_OMVs组均可显著引起促炎症因子IL-1β的含量升高（P＜0.05）；1μg/mL EcN_OMVs组可以显著提高促炎症因子TNF-α的表达（P＜0.05）；各浓度EcN_OMVs处理组均可显著提高IL-10的含量（P＜0.05）。（3）采用液相色谱-质谱联用技术对EcN_OMVs的蛋白组分进行分析，共鉴定出408种蛋白，发现这些蛋白来自周质间隙（40.69%）、胞质（31.37%）、外膜（10.78%）、内膜（9.31%）和胞外（7.84%）。利用GO二级分类和KEGG通路分析发现，这些蛋白参与益生菌在肠道中的正常生存（envC、FepA、OmpA、碳水化合物过程相关酶蛋白等）、粘附（flgA、flgI和fliC等）和免疫调节（OmpA、OmpF和flgH）等途径。 研究结论：EcN能够分泌OMVs作为信号分子的载体，引发RAW264.7细胞的促炎反应和抗炎反应，调节RAW264.7细胞生物功能，并且推测此OMVs中携带的鞭毛蛋白和外膜蛋白等与其引起的免疫反应相关。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 前言

1.2 大肠杆菌属Nissle 1917概述

1.3 细菌胞外囊泡研究进展

1.4 EcN及其OMVs对机体肠道黏膜免疫的调控

1.5巨噬细胞功能及其免疫应答产物

1.6 研究目的与内容

第二章 大肠杆菌属Nissle 1917胞外囊泡对巨噬细胞生物学功能的影响

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 大肠杆菌属Nissle 1917胞外囊泡蛋白组学分析

3.1 材料与方法

3.2生物信息学分析

3.3 结果与分析

3.4讨论

3.5 小结

第四章 结论

4.1 研究结论

4.2 创新点

4.3 下一步的研究思路

参考文献

附录

致谢

个人简历