水溶性镧系位移试剂对反式-4-羟基脯氨酸的手性识别

摘要

反式-4-羟基脯氨酸的L型异构体具有广泛的用途和独特的风味,可作生化试剂、香原料、增味剂、营养强化剂等,主要用于果汁、清凉饮料、营养饮料等;而其对映体D型异构体没有这些功效。诸如此类的例子非常多。一对手性对映体,特别是很多手性药物,常常因旋光性质的不同而引起生物活性、药效上的差异。因此,识别药物的手性构型,测定手性药物的手性对映体纯度的工作至关重要。
　　核磁共振(NMR)技术是化合物结构解析的一种常用手段,在药学领域科研和生产活动中发挥着越来越重要的作用。核磁谱图可为化合物的结构解析提供丰富有用的信息,为分子的结构鉴定提供重要的依据。随着谱仪硬件的升级和软件程序的开发应用,核磁共振技术越来越多地应用于药物的定量分析。近几年来,核磁共振技术在药物手性对映体的研究中也扮演着重要的角色。本工作在实验室已有条件的基础上,研究手性位移试剂对反式-4羟基脯氨酸对映体的手性识别。
　　论文第一部分详细解析了反式-4-羟基脯氨酸的核磁谱图特征。为了在谱图上有效识别D型和L型的共振信号,采用加入手性位移试剂的方法,人为地造成对映体分子磁环境差异。本论文的研究对象反式-4-羟基脯氨酸具有很好的水溶性,因此加入的手性位移试剂也应当能溶解于水。然而目前文献报道的水溶性位移试剂种类有限,已商品化的试剂更少。经调研,本论文选取Sm-pdta作为位移试剂,它具备了两个方面的特点。一是水溶性好,适合氨基酸类水溶性对映体的核磁分析。二是由Sm3+顺磁金属离子造成的核磁谱线增宽较其他镧系金属离子小,适合在高场核磁共振谱仪上进行对映体分析。
　　Sm3+金属离子通过与底物反式-4-羟基脯氨酸分子中的含有孤对电子的氧原子、氮原子发生配位作用,造成底物分子的原子核磁环境受Sm3+金属离子的干扰而发生化学位移偏移(Dd)。底物分子中手性位点上各取代基团距中心离子的距离、空间取向存在差异,受螯合的金属离子偶极磁场诱导产生的化学位移偏移也不同。诱导化学位移越大,对映体手性识别效果越好。
　　为了使诱导化学位移最大,我们分别分析了溶液酸碱度,位移试剂与底物摩尔比两个因素对手性识别效果的影响。实验结果表明,溶液pH影响Sm3+金属离子的螯合能力,pH过低,底物分子内羧基离子化不完全,与Sm3+金属离子螯合作用弱,诱导化学位移差值偏小;pH过高,Sm3+金属离子与强配位离子OH-发生不必要的络合,同样影响了Sm3+金属离子与底物分子的配位作用。因此,以对映体化学位移差值DDd为评价标准,最终选择最佳手性识别pH范围为9.6～10.2。研究位移试剂与底物摩尔比,可以发现,摩尔比并不是越大越好。摩尔比太大,对映体化学位移差值(DDd)大,但谱峰位移,造成相邻谱峰重叠。摩尔比太小,则对映体信号区分不明显。因此,综合评价化学位移差值和谱峰重叠两个因素,我们最终确定了位移试剂与底物的摩尔比为0.67。在pH9.6～10.2,摩尔比为0.67的条件下,L/D=7:3时,氢谱中对映体4位质子的DDd为44.3Hz,2位质子的DDd为83.9Hz,3a位质子的DDd为46.4Hz。碳谱中,3位碳原子的DDd为14.6Hz,4位碳原子的DDd为38.3Hz,5位碳原子的DDd为130.3Hz。
　　论文的第三部分考察了核磁共振在对映体过量值测定中的应用。首先,实验采用反转恢复法考察了溶液体系中氢原子核、碳原子核的弛豫特征。原子核的弛豫特征关系到定量结果的准确性,弛豫越充分,定量误差越小。原子核的弛豫性质反映在实验参数的设定上,对于氢谱,设定采样周期为4.7s;对于碳谱,设定采样周期为1.3s。然后,实验分别利用1HNMR和13CNMR方法测定对映体过量值。在1HNMR方法中,采用L型和D型对映体的3a位质子信号以及D型异构体的2位质子信号为定量特征峰,计算了7个不同L、D配比的样品的对映体过量值,与理论ee值作线性分析,得到线性相关系数为0.9999,这说明了定量结果稳定可靠。在13CNMR方法中,积分计算了7个不同L、D配比的样品中L型和D型的3位、4位、5位碳谱谱峰面积,然后根据积分面积计算对映体过量值,实验结果表明,5位碳的定量效果最佳,7个数据点线性关系良好,相关系数为0.9994;3位碳和4位碳在L:D比值为99.5:0.5时,受碳原子检测灵敏度的限制,低浓度D构型谱峰信噪比差,定量结果偏差较大。因此,将99.5:0.5这一组的定量数据除外,对余下的6个数据作线性分析,3位碳、4位碳的相关系数分别为0.9999和0.9993,定量数据可靠。
　　利用碳谱相对定量法测定手性对映体纯度,是目前核磁共振对映体分析中比较少用的方法,也是本论文的重点工作之一。碳谱定量最显著的优点是信号分布范围宽,每一条碳谱谱线代表一个位置碳原子,很少出现碳信号重叠,可选的定量峰较多。正如本实验中所证明的一样,3位,4位,5位碳信号均可以作为定量峰。随着探头检测灵敏度不断提高,13CNMR法将成为一种潜在的相对定量分析方法。
　　对于氢谱定量,由于氢核检测灵敏度高,是目前大多数文献采用的方法。在D型异构体浓度较低(0.5％)时,在氢谱中仍然能够观测到质子的共振信号,且定量结果可靠。然而氢谱定量的一个缺点是氢谱谱峰重叠不可避免,这导致特征峰选择困难,需要仔细分析各个谱峰,保证定量峰的D型、L型信号完全分离。然而碳谱定量受到检测灵敏度的限制。
　　综上,本论文所建立的手性位移试剂对水溶性手性对映体的识别条件和方法稳定可靠,采用1HNMR法和13CNMR法测定对映体纯度结果准确可靠,可为其他同类型的手性药物分析提供方法学参考。

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前 言

1 核磁共振简介

2 核磁共振方法在手性分析中的应用及现状

3 立题依据

4 研究思路

第一章 反式-4-羟基脯氨酸的结构分析

1.1仪器及试剂

1.2实验方法和条件

1.3化学位移归属

第二章 手性识别条件的建立

2.1仪器和试剂

2.2实验方法

2.3 结果与讨论

2.4 小结

第三章 手性对映体纯度的测定

3.1 弛豫特征的考察

3.2 实验方法

3.3 1H NMR法测定对映体过量值

3.4 13C NMR法测定对映体过量值

3.5 小结

总 结

参考文献

附图

综述

论著

个人简历

致谢