HaSNPV几丁质酶基因多拷贝重组菌株的筛选、表达、鉴定及其产酶条件的优化

摘要

棉铃虫是我国重要的农业害虫之一，常常造成巨大的经济损失。而化学农药长期大量的使用，不仅使得棉铃虫的抗药性剧增，且污染环境。棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)是棉铃虫专一性病原微生物，具有寄主范围特异、对靶标高毒力、无药害、使用安全、害虫不产生抗药性等优点，是理想的害虫控制因子。但传统病毒杀虫剂杀虫作用缓慢、范围窄等限制了它的使用。在HaSNPV基因组中发现的18家族几丁质酶基因是一个晚期非必需基因，与受染虫体液化和病毒侵染机制密切相关，因而对该基因进行深入研究，将对病毒杀虫剂的遗传改良和新的表达系统的建立有着重要的意义。 为了克服前期实验HaSNPV几丁质酶基因在原核表达系统中存在的不易分离纯化、蛋白无活性等问题，本研究尝试使用真核表达系统。实验中，首先将目的基因克隆构建到真核表达质粒pPIC9K中，测序鉴定重组子正确后，电转化毕赤酵母GSll5感受态细胞。经MM和MD平板筛选，获得了表型为Mut的转化子；在此基础上，再经过遗传霉素梯度抗性的筛选。该重组菌株以甲醇为诱导剂，30*(2下预表达，经SDS-PAGE鉴定，表达的目的蛋白(96小时)占总分泌蛋白的50％；经Schales法测定几丁质酶活性，发酵液上清中酶活达66t7(108小时)。 得到了经过鉴定的多拷贝重组菌株，实验接着对影响蛋白表达和产酶的6个影响因素进行了实验分析，获得了多拷贝重组菌株摇床水平的最佳培养条件。

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第一章文献综述

1 HaSNPV

1.1几丁质、几丁质酶及几丁质酶的分类

1.2杆状病毒几丁质酶

2巴斯德毕赤酵母表达系统

3本研究的目的、意义、内容和技术路线

第二章重组菌株的构建

1真核克隆常用方法和一般操作步骤

1.1合成新扩增引物

1.2目的基因的扩增

1.3 PCR产物胶回收

1.4目的基因与pMD18-T-Vecter连接

1.5制备E.coli DH5a感受态(CaCl2)

1.6转化过夜连接产物

1.7转化产物的筛选

1.8对构建质粒(pMD18-T-Vecter-ChiA)和表达质粒(pPIC9K)进行分步酶切并回收酶切产物

1.9连接目的基因和线性化的表达质粒

1.10转化连接产物

1.11对连接产物进行复筛

1.12合成测序引物

1.13用测序引物进行PCR鉴定

1.14 DNA测序

1.15毕赤酵母GS115的培养与保存

1.16毕赤酵母GS115感受态的制备

1.17含目的基因的表达质粒和亲本质粒的线性化

1.18电转化GS115感受态细胞

2 HaSNPV几丁质酶基因真核表达菌株的构建

2.1材料

2.2实验方法

2.3结果与分析

第三章重组菌株的筛选、表达和鉴定

1重组菌株的筛选、表达和鉴定

1.1概述

1.2实验方法

1.3重组菌株的筛选、表达和鉴定

2重组菌株几丁质酶活力的测定

2.1几丁质中还原糖含量测定方法的研究

2.2重组菌株几丁质酶活力的测定

第四章多拷贝重组菌株蛋白表达和产酶条件的优化

1材料

2方法

3结果与分析

4讨论

第五章结论

参考文献

附 录