柞蚕雄蛾提取液改善荷瘤大鼠放射后免疫抑制的机制研究

摘要

放射疗法是治疗恶性肿瘤的重要手段之一，以直接攻击肿瘤为目标，具有直接的即时疗效，但是也伴随出现多种副作用，尤其是放疗后可使荷瘤机体的免疫功能进一步降低，导致治疗失败。因此，放疗后免疫功能的恢复是放射治疗成败的关键因素之一。祖国医学在肿瘤的辅助治疗中具有独特的优势，治疗以扶正为主，配合活血化瘀、解毒散结的方法，以增强机体抵抗力，控制肿瘤复发转移。柞蚕蛾属药食同源昆虫，含有多种人体必需氨基酸和微量元素，其可食性和保健治疗作用早已被民间经验所证实。本课题组前期实验结果表明，柞蚕雄蛾提取液（the extract from malezooid of Antheraea pernyi）含有多种营养成分和生物活性物质，可显著增强小鼠细胞免疫功能，对小鼠体液免疫有一定增强作用，对小鼠单核吞噬系统功能有一定的增高趋势，且预实验发现柞蚕雄蛾提取液对荷瘤小鼠的肿瘤有明显的抑制作用。但国内外对蚕蛾及其有效成分的研究，尤其在改善放疗后荷瘤机体免疫抑制方面，目前尚缺乏全面的分子免疫水平的评价，因此，对柞蚕雄蛾提取液的免疫调节作用还有待深入研究。
　　 目的研究柞蚕雄蛾提取液逆转放疗后荷瘤大鼠免疫抑制的机制，以及对肿瘤组织缺氧微环境的影响，并初步探讨柞蚕雄蛾提取液对肿瘤的抑制作用及其可能机制，为柞蚕雄蛾提取液的开发利用提供实验理论依据。
　　 方法：雄性Wistar大鼠建立Walker-256（W256）荷瘤模型，随机分为对照组、模型组、放疗组、实验组及柞蚕雄蛾提取液组，给予常规放疗，柞蚕雄蛾提取液连续灌胃14天。末次给药24小时后，各组大鼠颈静脉采血，流式细胞术（FCM）检测外周血T淋巴细胞亚群变化；酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清中Th1/Th2细胞因子。处死动物，剥离脾脏、胸腺及肿瘤组织，称重并计算脏器指数及肿瘤抑制率。脾脏及肿瘤组织用10％中性福尔马林缓冲液固定、石蜡包埋及切片，采用免疫组织化学（SP）法检测脾细胞表达Th1/Th2细胞因子的变化及肿瘤组织中HIF-1α、VEGF、CD69及CD25的表达；原位杂交法检测肿瘤组织中HIF-1α mRNA表达。
　　 结果：
　　 1.柞蚕雄蛾提取液对荷瘤大鼠放疗后免疫功能的影响：放疗后荷瘤大鼠脾脏指数和胸腺指数明显降低（P<0.05），实验组脾脏、胸腺指数可恢复至正常水平（P<0.05）。流式细胞术检测结果显示，放疗组荷瘤大鼠外周血中CD4+T、CD8+T细胞百分比降低，CD4+/CD8+值降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。实验组荷瘤大鼠外周血中CD4+T、CD8+T细胞百分比和CD4+/CD8+值均较放疗组升高（P<0.05）。
　　 2.柞蚕雄蛾提取液对Th1/Th2细胞因子的影响：脾脏免疫组化实验结果表明IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10在正常大鼠脾脏中均有表达：放疗组脾脏中IL-2、IFN-γ表达无明显改变（P>0.05），而IL-4、IL-10表达增加（P<0.05）；实验组脾脏中IL-2、IFN-γ表达明显增加，而IL-4、IL-10表达下降，且差异均具有统计学意义（P<0.05）。ELISA检测血清实验结果表明放疗组血清中IL-2、IFN-γ细胞因子含量明显降低，而IL-4、IL-10细胞因子含量明显增高（P<0.05）；实验组荷瘤大鼠血清中IL-2、IFN-γ细胞因子含量明显增高，细胞因子IL-4、IL-10含量则有所降低（P<0.05）。
　　 3.肿瘤组织中HIF-1α和VEGF表达：免疫组化实验结果显示，放疗组肿瘤组织表达HIF-1α和VEGF蛋白表达有增强趋势（P>0.05）；实验组和柞蚕雄蛾提取液组肿瘤组织HIF-1α和VEGF的表达均显著减弱（P<0.05），且HIF-1α与VEGF呈明显正相关（r=0.649，P<0.01）。原位杂交实验结果显示，放疗组较模型组HIF-1α mRNA表达无统计学意义（P>0.05）；实验组及柞蚕雄蛾提取液肿瘤组织HIF-1αmRNA表达均降低（P<0.05）。
　　 4.肿瘤组织中CD69、CD25中表达：免疫组化实验结果表明，放疗组肿瘤组织表达CD69、CD25蛋白表达有减弱趋势（P>0.05）；实验组和柞蚕雄蛾提取液组肿瘤组织CD69、CD25的表达均显著增强（P<0.05）。
　　 5.HIF-1α与其他指标的相关性：将灰度值进行Spearman相关分析，HIF-1α与CD69、IFN-γ与呈负相关（r=-0.523，P<0.05、r=-0.474，P<0.05），与IL-4表达呈正相关（r=0.376，P<0.05），与其余指标表达的相关性无统计学意义。
　　 6.柞蚕雄蛾提取液对肿瘤生长的抑制作用：柞蚕雄蛾提取液小、中、大剂量组抑瘤率分别为10.9％、20.6％和34.0％，大、中剂量组均有明显的肿瘤抑制作用（P<0.05），且呈剂量（浓度）依赖性。
　　 结论：
　　 1.柞蚕雄蛾提取液可促进放疗后荷瘤大鼠T细胞增殖，诱导Th1类细胞因子的表达，促使Th2类细胞因子向Th1类细胞因子漂移，有效降低放疗对荷瘤大鼠引起的免疫抑制，改善荷瘤机体免疫功能。
　　 2.柞蚕雄蛾提取液可显著下调放疗后肿瘤组织及未放疗肿瘤组织中HIF-1α的表达，有效改善实体瘤缺氧微环境。荷瘤大鼠放疗后引起的T细胞免疫抑制可能与HIF-1α表达升高有关，且柞蚕雄蛾提取液可通过下调HIF-1α表达改善T细胞的免疫抑制。
　　 3.柞蚕雄蛾提取液有一定的抗肿瘤活性，其抗肿瘤效应可能是通过改善机体免疫系统的状态实现的。