双孢蘑菇高氧气调贮藏过程蛋白质变化规律的研究

摘要

本研究以双孢蘑菇为试验材料，主要围绕其蛋白质展开，分别从蛋白质的提取方法、蛋白质的 SDS-PAGE和双向电泳、差异蛋白点的质谱分析鉴定等方面进行。同时还对对照组和高氧气调组的生理和品质进行分析，包括失重率、白度、硬度、细胞膜透性、PPO和POD酶活性等方面，进一步通过双向电泳与质谱技术联用，分析在不同处理组中的蛋白质的表达，并对其差异蛋白点进行鉴定和功能分析。具体研究内容包括以下几个方面：
　　在单因素试验的基础上运用响应曲面法对 Tris-HCl法提取蛋白质的试验参数进行优化，确定最优工艺为提取液浓度2.0mol/L，提取液 pH8.4，提取时间8h，提取率可达75.09％。将此参数运用到 SDS-PAGE电泳中，改良 Tris-HCl提取方法，得到 SDS-PAGE图，分析双孢蘑菇蛋白质亚基多分布在26.4~80.8 kD。
　　比较 TCA/丙酮法、尿素法、酚提法、改良 Tris-HCl法对双孢蘑菇蛋白质的提取结果，并进行了 SDS-PAGE，分析各种方法提取到的蛋白质干粉的含量、蛋白纯度以及条带的清晰度、数量等，确定 TCA/丙酮法、改良 Tris-HCl法得到的蛋白干粉量最多，但是纯度低，而酚提法、尿素法得到的蛋白质干粉量少，但是纯度高，而且在 SDS-PAGE中蛋白条带数目多，蛋白条带清晰。酚提法纯度最高，效果最好。选用酚提法进行双向电泳。
　　将双孢蘑菇分 CK组、80%O2+20%N2组、100%O2组，探究高氧气调贮藏对其生理和品质的影响。测定指标有失重率、白度、硬度、细胞膜透性、可溶性固形物含量、PPO的活性、POD的活性和呼吸速率。结果发现，高氧气调贮藏对减轻其组织褐变、延缓衰老、延长货架期具有一定的影响，且100%O2组效果要略优于80%O2+20%N2组。在 SDS-PAGE图中，三组的蛋白条带数目、清晰度等差异不大。新鲜样与褐变初期样品无明显差异，褐变末期蛋白条带数目减少比较明显。
　　对 CK组和100%O2组的样品进行双向电泳分离蛋白质，通过串联质谱分析得到35个差异蛋白质点，对差异蛋白质点进行数据库检索得到相应的蛋白质，成功了34个点，失败了1个点，且这些差异蛋白质点在对照组中呈上调表达。对倍数变化大于2的差异蛋白点进行列表分析，鉴定到蛋白质名称为酪氨酸酶、甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶、硫-甲酰谷胱甘肽水解酶以及多数的未知蛋白。其中点6102覆盖率达到51%，得分为734。鉴定得到的蛋白质多为酶类活性物质，它们与能量代谢、组织褐变等过程有关。高氧气调贮藏有效的维持了双孢蘑菇的商品价值，延缓其后熟衰老进程，延长了货架期，蛋白质的鉴定与分析为其提供了理论依据。