基于表面增强拉曼光谱和多元统计分析的肝病血清快速检测技术研究

摘要

目的：
　　肝病的早期检测诊断对于病人的及时治疗意义重大，而现有的检测手段存在着检测周期长，成本较高等缺点，因而针对现有肝病早期诊断检测手段的一些不足，通过对正常人、几种慢性乙肝病患者（慢性乙型肝炎、慢乙肝肝硬化代偿期、慢乙肝肝硬化失代偿期）、肝癌四分期患者（极早期、早期、中期、晚期）和食管癌患者血清表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）进行研究，比较其光谱差别，并基于多元统计分析方法分析不同类型血清差异，建立肝病诊断模型，探索一种基于SERS的肝病快速无损检测技术，实现对肝病的早期诊断和及早防治。
　　方法：
　　通过比较金溶胶和银溶胶对血清的拉曼信号增强效果，选择一种对血清拉曼信号增强效果较好的纳米增强基底。
　　基于优化后的增强拉曼基底，分别对304例正常人血清、48例慢性乙型肝炎患者血清、49例慢乙肝肝硬化代偿期患者血清、48例慢乙肝肝硬化失代偿期患者血清、46例肝癌极早期患者血清、46例肝癌早期患者血清、49例肝癌中期患者血清、47例肝癌晚期患者血清和99例食管癌患者血清进行表面增强拉曼光谱信号测量；对拉曼光谱进行光谱平滑和基线扣除、归一化处理后，对不同类型血清拉曼光谱之间差异进行分析，并判断其拉曼峰归属。
　　基于有监督学习的正交偏最小二乘判别分析法（Orthogonalpartial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）多元统计分析方法，分别比较了正常人、所有肝病患者及食管癌患者的血清SERS谱的差别，慢性乙肝病和肝癌患者血清SERS谱的差别，慢性乙肝肝炎和慢乙肝肝硬化代偿期和失代偿期患者血清SERS谱的差别，肝癌极早期与肝癌早期、肝癌中期、肝癌晚期四者血清SERS谱的差别，使用主成分得分图、受试者工作特征曲线（Receive Operating Characteristic，ROC）对每种分类方法的模型进行分类效能评估，使用十折交叉验证对模型泛化能力进行评估，使用200次置换检验对观测值和模型稳健性进行评估；在模型分类效果较好情况下，分析模型的变量投影重要性值（Variableimportant projection，VIP），筛选VIP＞1的拉曼位移，并对所对应的拉曼峰的归属进行查找，进而对不同类别肝病间代谢物质差异查找原因。
　　基于无监督学习的主成分分组分析（Principal Component Analysis–CLASS，PCA-CLASS）的多元统计分析方法，同样比较了正常人、肝病患者和食管癌患者，慢性乙肝病和肝癌患者，慢性乙型肝炎和慢乙肝肝硬化代偿期和失代偿患者、肝癌四分期患者之间的血清SERS谱差异，且在按照不同分类方法比较时，分别建立了每个分组的独立PCA模型，保证了每个分组可以最大程度的保留样本的原始信息，使用Coomans’plot对模型的预测分组情况进行直观反映，根据样本到各个模型即坐标轴的距离，来对样本的分类状况进行大体评估，后使用ROC曲线对分类器效能进行整体评估。对分类效果较好的模型，同样使用十折交叉验证的方法对模型对于未知样本的泛化能力进行整体评估。
　　结果：
　　银溶胶对血清拉曼光谱的增强效果强于金溶胶4~5倍，因而本研究选用银溶胶作为SERS增强基底；比较了不同分组之间的血清SERS谱差异后，其差异峰多在以下位移处：556 cm-1、638 cm-1、724 cm-1、760 cm-1、811 cm-1、853 cm-1、888 cm-1、958 cm-1、1021 cm-1、1095 cm-1、1132 cm-1、1218 cm-1、1326 cm-1、1339 cm-1、1438 cm-1、1580 cm-1、1655 cm-1，其归属分别分：色氨酸、乳糖、乙酰辅酶A、色氨酸、L-丝氨酸，谷胱甘肽、酪氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、D-甘露糖、酰胺Ⅲ带、脂质、腺嘌呤、乙酰乙酸盐、酰胺I带。
　　基于OPLS-DA比较正常人、肝病患者和食管癌患者血清SERS谱差异时，主成分得分图显示三类样本有明显分离趋势，受试者工作特征曲线（ROC）图中，各分类的曲线下面积（Area Under The Curve，AUC）如下：AUC（正常人）=0.998，AUC（肝病患者）=0.997，AUC（食管癌患者）=0.997。十折交叉验证后，训练集和测试集的正确率分别为97.03％，95.33%。200次置换检验结果显示模型稳健。VIP筛选得到12个拉曼峰在组间差异大，且差异多由氨基酸、糖类、脂质等物质造成。基于PCA-CLASS比较三者时，ROC曲线图中，AUC（正常人）为1，AUC（肝病）为0.651，AUC（食管癌患者）为1。对模型进行十折交叉验证后，训练集的平均正确率为74.02%，测试集的平均正确率为57.53%。综合比较发现，PCA-CLASS区分肝病患者和正常人的分类效能低于有监督的OPLS-DA的分类效能。
　　基于OPLS-DA比较慢性乙肝和肝癌患者血清SERS谱差异，得分图中两类组间分离趋势明显，ROC曲线图中，两类患者的AUC值均为0.997。十折交叉验证后训练集和测试集的平均值分别为96.33%和94.27%，200次置换检验结果表明模型稳健。VIP筛选后得到8个位移处的拉曼信号强度在两组病人之间存在显著性差异，这多与肝脏器官进行的氨基酸代谢、糖代谢等代谢活动相关。基于PCA-CLASS分析，ROC曲线图中显示，慢性乙肝病患者AUC为0.765，肝癌患者的AUC为0.740，十折交叉验证后训练集和测试集的平均正确率分别为96.00%和85.00%，与OPLS-DA相比，两种方法用于临床样本判别分析的可行性都较高。
　　基于OPLS-DA比较慢乙肝和肝硬化代偿期和失代偿期之间差别，三类患者的主成分得分值在得分图上往三个方向延伸，分类趋势明显，ROC曲线图中，三者的曲线下面积分别为0.993，0.997，0.972。经十次交叉验证后，训练集和测试集的平均正确率分别为91.00%和87.00%；置换检验结果表明模型稳定；VIP筛选了14个拉曼位移在组间具有显著差异，其中，肝硬化不同阶段的谷胱甘肽、脂质和酪氨酸等物质含量存在差异；基于PCA-CLASS方法，三类患者的工作特征曲线下面积分别为0.837，0.933，0.954，十折交叉验证后训练集和测试集的正确率为87.81%和67.00%。
　　基于OPLS-DA比较肝癌四分期之间血清SERS谱差异，得分图显示四分期样本有往四方向分离趋势，但中间仍有交叉重叠，绘制的ROC曲线图中，肝癌四分期曲线下面积分别为0.996，0.998，0.989，0.992。在进行十次交叉验证后，训练集和测试集的平均正确率为88.77%，81.76%；200次置换检验回归线截距正常，表明模型稳健。依据VIP值，筛选出有效位移值有13个，这些物质在机体的生物转化、监视免疫过程、信号转导以及机体营养物质的代谢等一系列的生化反应中发挥关键作用。基于无监督的PCA-CLASS算法，绘制ROC曲线后，AUC(stage0)=0.857，AUC(stage1)=0.756，AUC(stage2)=0.809，AUC(stage3)=0.940，训练集和测试集正确率为78.71%和54.85%，表明 PCA模型相比OPLS-DA模型，其泛化能力一般。
　　结论：
　　基于SERS并结合OPLS-DA和PCA-CLASS两种多元统计分析方法的血清检测方法，对几种肝病的判别分类有较高正确率，且检测快速灵敏。综合各指标比较OPLS-DA与PCA-CLASS两种方法，有监督的OPLS-DA对各疾病的分类效果较好，且模型对未知样本的泛化能力较强，后期可同时参照两种分析方法，综合对样本进行分析预测。初步研究表明，本文建立的这种基于多元统计分析方法结合SERS的肝病血清快速无损检测技术，可为临床上肝病早期诊断的提供一种辅助手段。

目录

声明

缩略词表

第一章：前言

1. SERS技术概论

2. 多元统计分析方法概论及应用

3. 选题目的和研究内容

第二章：肝病血清表面增强拉曼光谱研究

1. 前言

2. 材料和方法

3. 结果

4 本章小结

第三章：基于多元统计分析方法的肝病血清SERS分析

1. 前言

2. 统计分析方法

3. 结果

4. 本章小结

第四章：基于多元统计分析方法的三种慢性乙肝病患者血清SERS分析

1. 前言

2. 统计分析方法

3. 结果

4. 本章小结

第五章：基于多元统计分析方法的肝癌四分期患者血清SERS分析

1 前言

2. 统计分析方法

3. 结果

4 本章小结

总结

1.全文总结

2. 主要创新点

3. 展望

参考文献

代表性论著

个人简介

在学期间发表论著

致谢