一种方便易用的A型肉毒毒素活性检测方法的建立

摘要

肉毒毒素（BoNT）是由肉毒梭菌在厌氧的情况下，产生的神经外毒素，依据毒素抗原性的不同，分A～G七个亚型，其中以A型的毒性最强，是生物毒素和化学毒物中毒性最强的物质，引起的临床症状也远远重于B型和E型。A型肉毒毒素现已被广泛应用于眼睑痉挛、面肌痉挛、脑瘫、整容除皱、瘦腿瘦脸等神经肌肉阻滞功能的治疗，多汗症、胃失弛缓症等自主神经系统功能紊乱的治疗以及偏头痛、慢性疼痛等感觉神经功能的治疗。
　　随着经济和社会的飞速发展，人们对美容的需求也越来越多。最近几年，使用肉毒毒素美容除皱、瘦腿瘦脸的爱美女士也越来越多。目前用于市场上的品牌有国外的Botox（保妥适，美国Allergen公司）、Dysport（英国Ipsen公司）、Myobloc（美国 Elan公司）以及国内BTXA（中国衡力）等。在我国，批准上市的用于肉毒毒素治疗疾病及美容目的的，只有美国的Botox（保妥适）和中国兰州生物制品研究所有限责任公司生产的衡力。Botox的治疗作用有颈部肌张力障碍、严重的原发性腋窝多汗症、神经源性逼尿肌过度活动、膀胱过度活动症、斜视、睑痉挛、慢性偏头痛、上肢痉挛。BTXA的治疗作用有眼睑痉挛、面肌痉挛的成人患者；急性麻痹性、内分泌肌病所引起的斜视和无法手术治疗12岁以上患者的斜视；暂时性改善65岁以下的眉间纹。但在这类肉毒毒素制品的使用过程中，也出现了一些中毒的案例，主要由注射剂量过大、注射部位药物不适当的弥散作用引起，不同程度的出现了眼睑痉挛、视物模糊、上睑下垂、饮水呛咳、吞咽困难、构音障碍、发声困难、肌力减退甚至呼吸困难等症状。
　　当肉毒毒素作为一种商业用的生物制剂，对其活性的研究尤为重要。生物制品普遍采用质量和活性两种表示方法，即单位质量的生物制品中所含有的生物学活性，反映活性组成比具体情况。本研究目的是研制一种方便易用的胶体金试纸条，基于金属锌的酶切反应动力学及免疫反应原理来检测肉毒毒素的活性。检测的原理为BoNT/A掺杂的血清样品和特别设计的底物肽在孵育一段时间后，可将特异性底物肽酶切从而使氨基端的生物素与羧基端的组氨酸标签分离，使得标记胶体金颗粒的链霉亲和素-底物肽复合物不能被层析试纸条的检测线上包被的抗组氨酸标签抗体捕获，从而呈现出一个不同于BoNT/A阴性血清的结果。
　　首先我们进行了 A、B型肉毒梭菌的人工培养。将 A型肉毒梭菌菌种接至TPYG液体培养基，进行肉毒梭菌的人工增菌培养。在37℃的厌氧温箱中培养48 h后，将获得的新鲜培养液接种至1 L的TPOM培养基进行产毒培养。用硫酸溶液沉淀抽提，得到粗毒。然后用硫酸铵沉淀，去除核酸。最后用凝胶柱和离子交换柱进行精制纯化。对纯化的肉毒毒素进行蛋白定量后用小鼠毒力试验来测定毒素的生物学活性。B型肉毒梭菌的培养、肉毒毒素纯化、定量及生物学活性鉴定同A型肉毒毒素，但没有精制步骤。由此而得到的A、B型肉毒毒素用于掺杂模拟临床血清样本。
　　然后设计 A型肉毒毒素底物序列如下： N端生物素化-TRIDEANQRATKM-6×His-Tag。该底物肽包含三个部分：N端生物素标签、A型肉毒毒素特异性底物肽序列和组氨酸标签。其中Q-R为BoNT/A特异性切割的位点。当BoNT/A对肽段发生作用时，作为肽链内切酶，会引起肽链断裂，从而产生含有不同生物标签的肽段，从而在胶体金试纸条上呈现不同的显色模式。将抗His标签单克隆抗体、抗链霉亲和素单克隆抗体分别作为T线和C线，胶体金包被的链霉亲和素作为探针按常规的制备方法制成层析试纸条后，我们对T线浓度、底物肽最小剂量、毒素和底物肽在体外孵育时间进行了优化。根据优化结果， T线浓度为1 mg/mL；特异性底物肽的优化剂量为1 ng/μL；毒素和底物肽的体外孵育时间为12 h。此外，我们用空白对照血清、B型肉毒毒素掺杂的模拟血清和不同稀释度的A型肉毒毒素掺杂的模拟血清对试纸条的特异性及灵敏性进行了评估。根据实验的结果，胶体金层析试纸条的最低检测限可达到1.3 LD50/mL，约为20 pg/mL，灵敏度与金标准的小鼠致死实验相当，但检测时间从4天减少到12 h。
　　本研究建立的方法样本和试剂消耗量少，检测流程短，操作简便易行，更适于在基层医疗机构和资源有限的偏远地区使用。通过检测活性肽酶的含量并优化酶联信号放大的反应条件，使针对有活性的A型肉毒毒素的检测较之前实验室使用的方法更加精确。在我国，肉毒中毒事件常集中发生在经济欠发达地区，交通的不便与专业设备的欠缺给肉毒中毒的诊断和救治带来很大的困难。该检测方法的建立可以有力的缓解上述地区感染肉毒中毒后的误诊及漏诊，提高诊治率。而且通过设计毒素特异性的底物肽的思路，该方案也可扩展用于其余血清型肉毒毒素的检测。此外，A型肉毒毒素目前被一些国际恐怖势力和极端组织用来制造恐慌，被列为最有可能使用的生物恐怖剂之一，因此研究它的检测对国防、军事也有着重要意义。我国现有的检测手段费时费力、成本高且需要具备专门知识的专业人员在设施齐备的专业实验室内进行。设计、开发一个快速、灵敏、方便易用的现场检测方法用于肉毒毒素的诊断和鉴定对我国的肉毒中毒，特别是目前尚无定论的婴幼儿肉毒中毒和食品安全保障体系的完善具有重大的现实意义和战略意义。

目录

声明

缩略词表

前言

一、肉毒梭菌

二、肉毒毒素

三、肉毒中毒

四、肉毒检测

第一部分 A、B型肉毒梭菌的培养及天然毒素的制备

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

第二部分 A型肉毒毒素活性检测的胶体金试纸条研制

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

结论

参考文献

发表文章:A Facile Lateral Flow Test for the Detection of Active Botulinum Neurotoxin Type A

个人简历

致谢