脊髓小脑性共济失调两个家系的分子遗传学研究

摘要

目的：
　　1.调查分析两个家系的家系成员患病情况，绘制完整的家系图谱，明确家系内各患病成员之间的关系。
　　2.明确两个家系所患疾病及疾病亚型，获知疾病累及范围及严重程度，为家系成员提供关于所患疾病的详细资料。
　　3.明确导致这两个家系SCAs的致病基因，了解家系中症状前人员携带致病基因情况。
　　4.分析致病基因致病的特点，为丰富和完善我国脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxias,SCAs)研究提供更多的参考资料。
　　内容：
　　1.调查两个遗传性SCAs家系成员发病情况，绘制家系遗传图谱。
　　2.对两个遗传性SCAs家系先证者进行详细的神经系统检查，明确诊断。
　　3.采用外显子捕获及二代测序技术，对两个遗传性SCAs家系中已经确定发病的患者的外周静脉血基因组DNA突变情况进行分析。
　　4.通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，琼脂糖凝胶电泳和直接测序的方法对外显子测序获得的突变基因进行验证，明确致病基因，分析研究其致病特点及分子机制。
　　方法：
　　1.本研究中的甘肃省家族遗传性神经系统疾病家系的先证者Ⅲ-7最初在甘肃省临夏州人民医院进行核磁共振扫描，初步诊断为脑萎缩，以小脑萎缩为著，后来结合先证者Ⅲ-7及其弟弟Ⅲ-5的临床学表现、影像学检查、家族遗传史等，在北京大学第三医院神经内科被诊断为SCAs,临床诊断符合Harding标准。
　　2.获知甘肃省渭源县患病家系的相关情况后，课题组成员先后两次远赴甘肃省渭源县进行详细的家系情况和家族遗传史调查，获得家系成员的知情与同意，并邀请先证者Ⅲ-7及其弟弟Ⅲ-5亲赴北京大学第三医院神经内科进行诊断，临床诊断为SCAs。
　　3.本研究中的河北-辽宁地区SCAs家系的先证者(Ⅲ-9)在北京大学第三医院神经内科确诊为SCAs，初步筛查排除了几种常见亚型的可能性，因此怀疑是一种新的亚型。
　　4.获知河北-辽宁地区患病家系的相关情况后，课题组成员邀请家系成员Ⅲ-5和Ⅲ-11亲赴北京大学第三医院神经内科进行诊断，临床诊断为SCAs。
　　5.在患者及其家族成员知情同意的情况下，详细讲解该疾病的致病原因及危害，以及对于家族后代的危害性，填写调查表和知情同意书，并对家系成员进行自愿性的外周静脉血抽取，各抽取5 mL外周静脉血，并放置于EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)抗凝管中，按调查表上的序列号做好标记，冻存于本室-80℃的超低温冰箱内。按照外显子测序对于样品的要求，将两个家系处理好的样品各两份送由深圳华大基因科技有限公司进行外显子捕获及二代测序，按要求提取两个家系内收集到血液样品的所有成员的基因组DNA(Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)，冻存于本室-80℃的超低温冰箱内用于后续实验。
　　6.对于两个家系患者的外显子测序结果进行统计和分析，分别得出家系患者共有突变基因，并设计引物，进行PCR扩增验证，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对于符合直接测序要求的样品送由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，对于不符合测序要求的重新设计引物验证，最终筛出与两个家系所患疾病相关的致病基因，获知疾病的基因亚型，分析研究致病机制，为后续做出症状前诊断提供依据。
　　结果：
　　1.对于甘肃省渭源县SCAs家系，在深圳华大基因科技有限公司进行外显子测序的两位患者Ⅲ-5和Ⅱ-8的测序结果与人类基因组参考序列(UCSC hg19 version)比对，两位患者相同的突变为84个点突变位点和8个插入缺失突变基因。结合临床诊断结果，首先选取8个插入缺失突变基因中的ATXN2基因进行PCR验证。最终确定该家系为CAG三核苷酸重复序列动态突变引起的常染色体显性遗传性脊髓小脑性共济失调Ⅱ型(spinocerebellar ataxiastype2，SCA2)，基因诊断还发现该家系中有7名致病等位基因携带者。
　　2.对于甘肃省渭源县SCA2家系，对46位家系成员进行了突变基因ATXN2的检测，PCR扩增检测基因内CAG三核苷酸的重复次数。结果发现家系中的6例患者Ⅱ-8、Ⅲ-5、Ⅲ-7、Ⅲ-21、Ⅳ-8、Ⅳ-10及7例致病等位基因携带者Ⅲ-13、Ⅳ-1、Ⅳ-6、Ⅳ-19、Ⅴ-1、Ⅴ-3、Ⅴ-5的PCR产物电泳图的电泳条带上出现了明显的2条大小不等的条带，而家系中其他成员未出现该现象。这是因为理论上针对这一位点而言，每个个体PCR产物都是两个条带(一对等位基因)，正常人两条等位基因的CAG重复次数相同或者差距较小，在电泳图上无法区分，但是患者和携带者的PCR产物的正常等位基因明显比异常等位基因小，在电泳图上可分辨出来。根据测序结果计数致病基因ATXN2的CAG(反向为CTG)三核苷酸重复次数，结果显示患者及致病等位基因携带者异常等位基因的CAG重复次数为40～48次，明显超出正常范围(13～31次)，剩余家系成员突变基因ATXN2的两条等位基因的CAG重复次数均在19～25次，属于正常范围。
　　3.对于河北-辽宁地区SCAs家系，在深圳华大基因科技有限公司进行外显子测序的两位患者Ⅲ-5和Ⅲ-11的测序结果与人类基因组参考序列(UCSC hg19 version)比对，两位患者相同的突变为15个点突变位点。初步筛查出5个基因(即FERMT1，S100A12， SPATC1，SPTB，ZNF334)可能与该家系的SCAs相关，，暂时无法明确为哪种亚型，需要后续继续研究分析。
　　结论：
　　1.本研究中的两个遗传性SCAs家系患者临床症状上均表现出行走不稳伴持物不稳，步态失调，饮水呛咳，轻度构音障碍，指鼻及跟-膝-胫试验欠稳妥，轮替障碍，辨距不良等；头部MRI(Magnetic Resonance Imaging，核磁共振成像)检查显示脑萎缩，以小脑萎缩为著；肌电图检查提示肌张力障碍和腱反射减弱。两个家系患者的临床症状均符合SCAs的典型症状，但不同患者的临床表现和同一位患者在不同患病阶段得临床表现存在明显差异，即存在明显的临床和遗传异质性。
　　2.对于诊断为SCA2(Spinocerebellarataxia type2)的甘肃省患病家系,家系成员之间不存在明显的遗传早现现象，且患者均不存在智力障碍，这与部分报道不一致。
　　3.初步诊断为SCAs的河北-辽宁患病家系，初步筛查出5个候选基因，即FERMT1，S100A12，SPATC1，SPTB，ZNF334，可能与该家系的SCAs相关，但还需要进一步研究分析。
　　4.SCAs的明确诊断和分型不能仅仅依靠临床诊断，因为SCAs具有高度的临床和遗传异质性，且各亚型之间有不少重叠症状，必须结合基因诊断。

目录

声明

缩略词表

前言

第一章脊髓小脑性共济失调两个家系的患病情况调查与临床诊断

2.家系患者临床诊断

3.家系成员患病情况调查与临床诊断结果

4.讨论

第二章脊髓小脑性共济失调两个家系患者的外显子测序与分析

1.方法与内容

2. 外显子测序数据分析( 以河北- 辽宁SCAs 家系为例)

3.结果

4.讨论

第三章脊髓小脑性共济失调两个家系相关人员的基因检测

1.方法与内容

2.结果

3.结论

讨论

1. 甘肃省SCAs家系患病情况分析与讨论

2. 河北-辽宁SCAs家系患病情况分析与讨论

3.问题与展望

结论

参考文献

个人简历

致谢