条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因（PyTPS）的克隆、遗传转化及与其它藻类TPS基因的比较遗传学研究

摘要

海藻糖是一种广泛存在于自然界中的非还原性双糖。研究表明它与生物体抗干旱、盐碱、低温等逆境的能力有关；将大肠杆菌和拟南芥的海藻糖合成酶基因导入植物，可以提高植物抗干旱、抗盐碱的能力。但对生活于海边潮间带、具有高度抗盐、抗旱能力的海藻的海藻糖合成酶基因(TPS)的克隆和遗传转化迄今尚未见任何报道。 本实验室从条斑紫菜中克隆了海藻糖合成酶基因(PyTPS)，获得了其核DNA和cDNA序列，二者都为2727bp，没有内含子。将对应的蛋白质序列与其它物种的聚类分析得知，PyTPS与水稻TPS(OsTPs，Accession No．XP_475716)和拟南芥TPS(AtTPS5，Accession No．．NP_567538)的同源关系最近(约40％)。构建了PyTPS基因原核表达载体pET22b-PyTPS并将其在大肠杆菌BL21中进行了表达；构建了真核表达载体pcAMBIA2300-PyTPS并将其通过农杆菌介导法转入水稻品种TP309，经过抗生素筛选和PCR检测后，得到201个T0代转基因植株系。经扩繁、筛选、鉴定，得到131个T1代转基因株系，经过8‰的NaCl盐溶液筛选和分子检测后，共得到78株阳性的植株，分别来自27个株系。经进一步扩繁、筛选、鉴定，得到三个较纯合的T2代转基因株系；其PCR检测和Southern杂交检测都呈阳性，表明PyTPS基因已整合到这些转基因株系中。对它们的抗盐性测定表明，它们的抗盐性较对照有明显提高。 随后，利用同源克隆的方法从来自红藻、褐藻及绿藻的七种海藻(海带、坛紫菜、龙须菜、角叉菜、礁膜、浒苔、孔石莼)的基因组DNA中克隆了它们的TPS基因，它们DNA序列与条斑紫菜的大小完全一样，均为2727bp。用DNAMAN软件进行比较分析发现这八种海藻的TPS基因DNA序列的一致性高于94％；而它们氨基酸序列的一致性高于97％，推测它们的功能可能也是相似的。将推导出的各自的氨基酸序列提交到PSIPRED蛋白质结构预测服务器进行二级结构的预测，发现除了坛紫菜以外，其它七种海藻的TPS二级结构间差异很小。选取海带的TPS基因(LjTPS)，也构建了其原核表达载体pET22b-LjTPS，发现它在大肠杆菌BL21中表达出的蛋白的大小与pET22b-PyTPS表达出的蛋白大小一样． 将获得的八种海藻的TPS与其它物种的TPS进行了氨基酸序列比对时，发现与其它物种间的一致性较低，其中一致性最高的是水稻和拟南芥，他们与海藻TSP氨基酸序列的一致性达到40％，一致性次之的是酵母的TSP，他们的一致性只有27％左右；最低的是与大肠杆菌的EcotsAB的一致性，他们的一致性仅有20％左右。在对上述的TPS基因的(G+C)含量进行分析时，发现海藻TPS基因的(G+C)含量都为60％左右，远远高于水稻、拟南芥、酵母和大肠杆菌。

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声明

文献综述

1.植物基因组学研究

1.1结构基因组学(structural genomics)

1.2功能基因组学(functional genomics)

1.3比较基因组学(Comparative Genomics)

1.4海藻的基因组学研究

2. 6-磷酸海藻糖合成酶的研究概况

2.1海藻糖的生物学功能

2.2海藻糖的代谢途径及其相关基因

2.3 6-磷酸海藻糖合成酶基因(TPS)与植物抗盐性的研究

第二部分 研究的立题依据和意义

第三部分 研究内容

第一章 条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因(PyTPS)的克隆和功能研究

1.材料

2 方法

3.结果与分析

4 讨论

第二章 八种藻类TPS基因的比较研究

1.材料

2.实验方法

3.结果

4 讨论

第四部分 结论

参考文献

致谢