氧化葡萄糖杆菌产右旋糖酐糊精酶的发酵过程优化

摘要

本文以氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶(DDase)为主要研究对象，在建立了其分析和检测方法的基础上，对氧化葡萄糖杆菌DDase培养基和发酵工艺进行了优化。
　　 1.应用细胞透性化技术快速提取测定氧化葡萄糖杆菌胞内右旋糖酐糊精酶。
　　 本文研究了应用细胞透性化技术破碎氧化葡萄糖杆菌(GluconobacteroxydansM5)以提取并测定胞内右旋糖酐糊精酶(DDase)。根据单因素试验和正交试验设计确定了从氧化葡萄糖杆菌细胞中提取DDase的最佳方法:甘氨酸浓度(w/v)=15％,TritonX-100浓度(v/v)=1％，菌悬液OD600=0.5～6，pH=6.81，冰浴处理时间=1h。该研究将细胞透性化技术应用到右旋糖酐酶的提取检测过程中，与超声波细胞破碎法相比，该方法条件温和，酶的释放率较高并易于放大，同时细胞透性化技术使胞内酶在稳定的细胞内环境中发挥作用，从而提高其稳定性和催化效率。
　　 2.DDase合成过程的发酵调控关键是对发酵培养基以及培养条件的调控，通过对这些因素的调控达到最大限度地调节代谢向合成产物方向进行，最终达到高产的目的。培养基组分中的碳源、氮源、微量元素和无机盐等多个因子都会对氧化葡萄糖杆菌的生长以及DDase的合成进行调控，同时还影响到产物的进一步分离提取工作和产物的质量。因此，在生产过程中只有选用良好的培养基成分和配方才能达到最优效果。氧化葡萄糖杆菌DDase培养基的优化首先采用单因素筛选法，筛选出最佳碳源、氮源和金属离子，并应用Plackett-BurmanDesign设计和ResponseSurfaceMethodology设计，对摇瓶发酵培养基进行了优化，得到比较合适的培养基，最终确定培养基的最优配方为:葡萄糖17.670g/L，麦芽糖30g/L，胰蛋白胨12.198g/L，酵母粉13.528g/L，硝酸铵15g/L，CuSO40.01g/L，ZnSO40.01g/L，NaCl0.009g/L，初始pH6.0。研究发现，葡萄糖、胰蛋白胨、酵母粉和NaCl是影响DDase产量的重要因素。优化后，酶活由0.037U/mL提高到0.238U/mL，是目前文献中所报道的最高值。
　　 3.为了进一步提高氧化葡萄糖杆菌右旋糖酐糊精酶的产量，本文在应用响应面法优化了培养基的基础上，对其它培养条件进行了优化。结果表明，在种龄27h，接种量12.5％，装液量25mL，pH3.5时酶活达到最高。生长曲线显示，pH4.0最有利于菌体生长，而pH3.5酶活达到最高值。因此，为得到最高酶活，将培养基由pH4.0调整为pH3.5，结果表明:在发酵时间6h调整pH酶活达到最高。

目录

摘要

符号和缩略词说明

第一章 文献综述

1．1 右旋糖酐的研究进展

1．1．1 右旋糖酐简介

1．1．2 右旋糖酐的合成研究进展

1．2 右旋糖酐糊精酶的研究概况

1．2．1 右旋糖酐糊精酶的产生菌

1．2．2 右旋糖酐糊精酶的基础研究

1．2．3 右旋糖酐的应用价值和市场需求

1．3 立题依据

1．4 研究内容

1．4．1 快速提取胞内酶的细胞透性化技术研究

1．4．2 发酵培养基的优化

1．4．3 发酵工艺的优化

第二章 快速提取胞内酶的细胞透性化技术研究

2．1 前言

2．2 试验材料

2．2．1 主要仪器

2．2．2 主要试剂

2．2．3 菌种

2．2．4 斜面培养基

2．2．5 种子培养基

2．2．6 发酵培养基

2．3 方法

2．3．1 细胞培养

2．3．2 胞内酶提取

2．3．3 透性化条件

2．3．4 分析方法

2．4 结果与分析

2．4．1 透性化处理单因素试验

2．4．2 透性化处理正交试验

2．4．3 确定菌体浓度

2．5 结果与讨论

第三章 响应面设计优化氧化葡萄糖杆菌DDase发酵培养基

3．1 前言

3．2 试验材料

3．2．1 主要仪器

3．2．2 主要试剂

3．2．3 菌株

3．2．4 培养基

3．2．5 培养方法

3．2．6 分析方法

3．2．7 试验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 碳源的优化

3．3．2 氮源的优化

3．3．3 金属离子的优化

3．3．4 Plackett-Burman Design设计

3．3．5 Response Surface Methodology分析实验

3．4 小结

第四章 发酵工艺研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 菌种

4．2．2 仪器与试剂

4．2．3 培养基和培养方法

4．2．4 分析方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 种龄的优化

4．3．2 接种量的优化

4．3．3 装液量的优化

4．3．4 发酵培养基pH的优化

4．4 小结

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间以第一作者发表的论文

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