热应激对小鼠卵母细胞和附植前胚胎及生殖器官氧化损伤的影响

摘要

本研究对雌鼠、卵母细胞（体内）和附植前不同发育时期胚胎（体内和体外）施以热应激后，检测卵母细胞、胚胎和生殖器官中TGSH和MDA的浓度，以及后续胚胎发育能力。以确定热应激是否诱导卵母细胞和附植前不同发育时期胚胎发生氧化损伤，以及不同发育时期胚胎对热应激的耐受性是否一致，从而进一步明确热应激影响母畜生殖能力的机制。
　　 试验方法:
　　 1.选取8w健康雌性昆明小鼠随机分为6个热应激处理组:37℃1h、37℃2h、39℃1h、39℃2h、41℃1h、41℃2h。每天热应激1次，连续热应激1周。采用总谷胱甘肽和微量MDA测定试剂盒检测肝脏、卵巢、输卵管和子宫中TGSH和MDA的浓度。
　　 2.将超排后的小鼠置于35℃热环境中持续应激6h，获得受热应激卵母细胞;然后再将热应激后的雌鼠与雄鼠1∶1合笼，于次日凌晨检查阴栓，从而获得来自热应激卵母细胞的合子期胚胎。采用总谷胱甘肽和微量MDA测定试剂盒检测卵母细胞及其合子期胚胎中TGSH和MDA的浓度，同时观察合子期胚胎的囊胚孵出率。
　　 3.将超排后的雌鼠与雄鼠1∶1合笼过夜，于次日凌晨检查阴栓（将注射hCG后记为第1d）。将检出阴栓的小鼠置于35℃热环境中持续12h，获得发育至第1d、遭受热应激的胚胎;第2d，将检查出阴栓的小鼠于同一时间施以同样的热应激，获得发育至第2d、遭受热应激的胚胎;依次类推，分别获得发育至第3d、第4d和第5d受热应激的胚胎。热应激处理结束的胚胎一部分用于TGSH和MDA的检测，一部分继续体外培养至孵出囊胚以观察胚胎的发育率。
　　 4.将超排后的雌鼠与雄鼠1∶1合笼过夜，把次日检出阴栓的小鼠处死，取出合子期胚胎进行体外培养。将发育至第1～5d的胚胎分别经39℃热应激处理12h，依次获得发育至第1～5d受热应激的胚胎。热应激结束后，检测胚胎中TGSH和MDA的浓度。
　　 试验结果:
　　 1.随着热应激温度升高和时间延长，肝脏扣输卵管中TGSH显著降低(P＜0.05)、MDA显著升高(P＜0.05)，热应激组较对照组均差异显著(P＜0.05)。当温度达到41℃（不包括37℃和39℃）时，卵巢和子宫中TGSH和MDA浓度较对照组差异显著(P＜0.05)。
　　 2.母源热应激的卵母细胞及其合子期胚胎中TGSH和MDA的浓度较对照组未有显著变化(P＞0.05)，合子期胚胎的囊胚孵出率显著低于对照组(P＜0.01)。
　　 3.经母源热应激后，与对照组相比较，发育至1～3d的胚胎的后续胚胎发育率极显著降低(P＜0.01)，胚胎中TGSH浓度下降(P＜0.01)、MDA浓度升高(P＜0.01)，发育至第4～5d的胚胎中TGSH和MDA的浓度及胚胎发育率均未有显著变化(P＞0.05)。
　　 4.发育至1～5d的体外培养的胚胎分别经39℃处理12h后，胚胎中TGSH和MDA未有显著变化(P＞0.05)。
　　 结论:
　　 发育至1～3d的胚胎遭受母源热应激后，发育能力降低，这与热应激所诱导的氧化损伤密切相关，但是母源热应激后卵母细胞后续胚胎的发育能力降低与氧化损伤无关。体外培养的胚胎经39℃处理12h后，对附植前胚胎氧化损伤和孵出率均无影响。

目录

摘要

英文缩写词表

文献综述

1 前言

2 热应激对雌性动物生殖机能的影响

2．1 热应激对发情的影响

2．2 热应激对受胎率的影响

2．3 热应激对胚胎成活率的影响

2．4 热应激对产仔数的影响

2．5 热应激对其它繁殖性能的影响

3 氧化损伤对卵母细胞和附植前胚胎成熟和发育的影响

3．1 卵母细胞成熟

3．2 早期胚胎发育

3．3 氧化损伤对早期胚胎的影响

4 GSH在卵母细胞成熟、受精及早期胚胎发育过程中的作用

4．1 卵母细胞中的GSH

4．2 GSH参与精子染色体解凝、卵母细胞激活、雄原核形成等过程

4．3 GSH参与早期胚胎发育过程

4．4 哺乳动物卵母细胞成熟过程和受精后GSH水平变化

4．5 成熟环境和卵丘细胞对卵母细胞GSH合成的影响

5 热应激对ROS代谢的影响

6 热应激对哺乳动物卵母细胞和早期胚胎发育能力的影响

6．1 热应激对卵母细胞成熟和发育能力的影响

6．2 热应激对附植前胚胎发育能力的影响

7 研究目的及意义

第一部分 热应激对小鼠生殖器官氧化损伤的影响

1 试验材料

1．1 试验动物

1．2 试剂和仪器

2 试验方法

2．1 雌鼠热应激处理

2．2 组织中MDA浓度的测定

2．3 组织中TGSH浓度的测定

2．4 数据处理

3 结果

3．1 热应激对小鼠肝脏氧化损伤的影响

3．2 热应激对小鼠生殖器官氧化损伤的影响

4 讨论

第二部分 母源热应激对小鼠卵母细胞及其合子期胚胎氧化损伤及发育能力的影响

1 试验材料

2 试验方法

2．1 CZB培养液的配制

2．2 小鼠超排处理

2．3 母源热应激卵母细胞以及受精

2．4 卵母细胞及其合子期胚胎的采集和处理

2．5 胚胎的体外培养

2．6 母源热应激卵母细胞受精后胚胎的囊胚孵出率

2．7 卵母细胞及其合子期胚胎中TGSH浓度的测定

2．8 卵母细胞及其合子期胚胎中MDA浓度的测定

2．9 数据处理

3 结果

4 讨论

第三部分 母源热应激对小鼠附植前胚胎氧化损伤及发育能力的影响

1 试验材料

2 试验方法

2．1 小鼠超排处理

2．2 母源热应激胚胎

2．3 胚胎的采集

2．4 胚胎的体外培养

2．5 母源热应激胚胎的囊胚孵出率

2．6 胚胎中TGSH和MDA浓度的测定

2．7 数据处理

3 结果

3．1 母源热应激对不同发育阶段胚胎氧化损伤的影响

3．2 母源热应激对胚胎发育能力的影响

4 讨论

第四部分 热应激对体外培养的小鼠附植前胚胎氧化损伤的影响

1 试验材料

2 试验方法

2．1 小鼠的超排处理

2．2 胚胎的采集

2．3 胚胎的体外培养

2．4 体外培养的胚胎的热应激处理

2．5 测定热应激体外培养胚胎中TGSH和MDA的浓度

2．6 数据处理方法

3 结果

3．1 热应激对体外培养的胚胎中TGSH浓度的影响

3．2 热应激对体外培养的胚胎MDA浓度的影响

4 讨论

结论

参考文献

致谢

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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