鹦武喙羽病病毒和禽多瘤病毒的全基因组序列分析及鹦鹉喙羽病病毒ORFC1的原核表达

摘要

禽多瘤病毒感染症(Avian Polyomavirus infection，APV感染症)和鹦鹉喙羽病(Psittacine Beak and Feather Disease，PBFD)被认为是影响禽类羽毛和外观的两大代表性疾病。鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)，属于圆环状病毒科(Circoviridae)环状病毒(Circovirus)，可感染约60种的野生及宠物鹦鹉，能引起患乌免疫抑制，危害严重。此病在我国台湾有过报道，在大陆还未曾见过报道。APV感染症，又称鹦鹉幼雏病，主要引起鹦鹉幼雏的急性致死性疾病，其死亡率可高达100％。本文主要完成了以下工作:
　　 (1)利用PCR方法对来自山东的9份濒死虎皮鹦鹉病料进行APV和PBFDV的检测，9份病料中有6份PCR检测为APV阳性，1份检测为PBFDV阳性，2份为APV和PBFDV混合感染，PCR产物序列分析的结果可以确认本病例鹦鹉有PBFDV和APV的感染，这是我国大陆首次报道鹦鹉喙羽病，也是我国大陆首次报道虎皮鹦鹉APV和PBFDV的混合感染。
　　 (2)利用分段PCR扩增的方法对APV和PBFDV的全基因组进行了扩增，测序结果分析可知，本文分离到了2株APV分离株，一株为青岛株QD-JM01，一株为潍坊株WF-GM01;此外，在青岛养殖场还分离到一株PBFDV分离株QD-CN01，为我国大陆分离到的第一株PBFDV。
　　 Blast分析，综合DNAstar软件分析可知，APV分离株QD-JM01株和WF-GM01与GenBank中全部的APV毒株同源性极高，为99.3％～99.9％。全基因组序列多重比对分析表明，QD-JM01株共有11处发生了核苷酸变异，最显著的是在第246位(非编码区)插入了14个碱基，有3处能引起氨基酸的变异。WF-GM01株有14个位点发生碱基改变，其中VP1变异率最高，有5个碱基位点发生改变。其次T抗原变异率较高，有4处碱基发生改变，其中，VP1区域及T抗原分别有4个位点引起氨基酸变异。PBFDV青岛分离株QD-CN01，全长2003bp，与GenBank中已发表PBFDV分离株全序列同源性为83.0％～95.0％。与之前报道的PBFDV呈现相似的基因组结构，包括主要ORF的大小以及位置，位于Cap和Rep之间的茎环结构的序列及位置等。利用Mega4.0软件构建系统进化树，分析表明这些同源性极高的APV分离株，与地理分布没有明显关联，并不形成地理隔离，与宿主也不呈明显关联;来源于不同宿主的PBFDV分离株与宿主关系紧密，与地理来源也呈一定相关，我国的QD-CN01分离株位于由6株分离自日本的分离株构成的虎皮鹦鹉特异基因型分支上。
　　 (3)根据已测鹦鹉喙羽病病毒青岛分离株(QD-CN01)全基因序列，设计一对表达QD-CN01株ORFC1基因(750bp)的引物，将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组pET-ORFC1质粒。通过对诱导时间，IPTG终浓度，以及菌体OD值进行筛选优化，经IPTG诱导后成功地在BL21宿主菌中表达分子量约为28.9kDa的融合蛋白。蛋白表达的PBFDV重组衣壳蛋白可以作为免疫原制备抗血清及单克隆抗体，也为研制基因工程疫苗和诊断试剂盒提供必备的筛选用试剂。

目录

摘要

缩略词表

文献综述

1 禽多瘤病毒感染症

2 鹦鹉喙羽病

3 研究的目的意义

试验一 禽多瘤病毒感染症及鹦鹉喙羽病的PCR检测

1 试验材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

试验二 禽多瘤病毒及鹦鹉喙羽病病毒的全基因组测序及序列分析

1 试验材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

试验三 鹦鹉喙羽病病毒ORFC1基因的克隆与原核表达

1 材料

2 试验方法

3 结果

4 讨论

5 小结

创新点

参考文献

攻读硕士期间发表的文章

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