小反刍兽疫病毒疫苗株与4系野毒株RT-PCR鉴别方法的建立及岩羊分离株的基因序列分析

摘要

小反刍兽疫（Peste des Petits Ruminants, PPR）由副粘病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus, PPRV)引起，以发热，眼、鼻有大量浆性分泌物、溃疡和坏死性口腔炎，胃炎，腹泻和肺炎为特征的一种严重的烈性、接触性传染病。主要感染小反刍兽，特别是山羊和绵羊高度易感。PPR严重威胁着动物卫生安全和畜牧业的发展，是需要采取严厉的强制预防，控制和扑灭的动物疫病之一。2007年7月，我国西藏自治区阿里地区日土县发生PPR疫情，这是我国首次发生PPR。疫情发生后，立即对疫区及周边地区的绵羊、山羊接种小反刍兽疫Nigeria75/1疫苗进行预防免疫，但是弱毒株的存在可能会干扰PPR的血清学调查，导致无法与野毒感染进行区分。
　　 针对上述情况，本研究采用根据H基因的多变区域设计特异性引物H1a/H2b联合OIE规定的基于N基因检测PPRV的标准通用引物NP3/NP4，建立区分PPRV野毒株与疫苗株的联合RT-PCR方法。结果表明，针对N基因的RT-PCR方法能同时检测PPRV野毒株与疫苗株;而针对H基因的RT-PCR方法只能检测PPRV4系野毒株，不能检测PPRV疫苗株。根据2次RT-PCR反应的结果，能够很好的区分PPRV4系野毒株与疫苗株。而且可检测到的最低模板量可达7.7×10-3 ng/μl，该值完全可以满足作为诊断方法的要求。总之该检测方法可以成功的扩增出国内流行的毒株，专一性好，灵敏度高，准确度高，因此有潜力用于兽医临床上小反刍兽疫病毒疫苗毒与野毒的鉴别诊断。
　　 根据Genbank中发表的PPRV基因序列，我们设计14对扩增引物、91条测序引物运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获取了覆盖岩羊分离株（简称Tibet/07-Y）全基因组的14个重叠片段。病毒RNA的5’及3’端的序列通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获取。该Tibe/07-Y分离株全长为15948bp与已发表的PPRV毒株序列长度相同，全基因组编码6种结构蛋白，各个蛋白的基因起始、终止序列在进化上的保守性很高。与PPRV基因4系毒株PPRV/China/Tibet/Geg/07-30（简称Tibet07-30）、Turkey2000，基因2系毒株Nigeria75/1与Nigeria76/1，基因1系毒株C(o)te d' Ivoire89的核苷酸同源性分别为99.7％、92.6％、89.5％。
　　 对Tibet/07-Y的H基因进行分子生物学特征分析，发现H基因由1957个核苷酸组成，编码区有1830个核苷酸共编码609个氨基酸，与其他PPRV分离株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.6％-99.7％和89.3％-99.7％。与麻疹病毒属的其他病毒的核苷酸和氨基酸同源性为46.2-54.8％和33.4-55.2％。H蛋白的疏水区高度保守，N末端锚定区由38-58个氨基酸组成。H蛋白含有13个半胱氨酸残基、37个脯氨酸及四个潜在的N-糖基化位点，分别命名为N172 KSK175、N215 VSS218、N279MSD282、N18KTH21。

目录

摘要

缩略词

第一章 小反刍兽疫的研究进展

1 小反刍兽疫病毒简介

1．1 病原的发现

1．2 小反刍兽疫病毒的流行概况

1．3 PPRV的特征

1．4 小反刍兽疫病毒最新研究进展

2 流行病学

2．1 易感动物

2．2 地理分布

2．3 传播途径

2．4 临床症状

3 小反刍兽疫诊断技术最新研究进展

3．1 样品采集

3．2 免疫学试验方法

3．3 病毒分离鉴定

3．4 RT-PCR

3．5 病毒中和试验

4 中国小反刍兽疫病毒病风险初步分析

5 防控

5．1 小反刍兽疫病毒在我国传播的风险控制

5．2 免疫和治疗

第二章 小反刍兽疫病毒疫苗株与4系野毒株RT-PCR鉴别方法的建立

1 材料与方法

1．1 生物材料

1．2 病料

1．3 试剂和仪器

1．4 引物的设计

1．5 病毒RNA的提取

1．6 RT-PCR扩增条件的优化

1．7 灵敏度试验

1．8 专一性试验

2 实验结果

2．1 PCR扩增条件的优化

2．2 灵敏度试验

2．3 专一性试验

2．4 PPRV野毒病料与疫苗毒的对比检测试验

3 讨论

第三章 RT-PCR鉴别方法的应用

1 材料与方法

1．1 病料

1．2 试剂及舣器

1．3 病料的处理及RNA的提取

1．4 PPRV通用／特异RT-PCR的检测

1．5 PPRV通用／特异RT-PCR扩增产物的测序

2 结果

2．1 PPRV通用／特异RT-PCR检测结果

2．2 PPRV通用／特异RT-PCR扩增阳性样品的测序结果

3 讨论

第四章 岩羊分离株的基因序列分析

1 材料

1．1 病料来源

1．2 主要分子生物学试剂

1．3 主要仪器设备

2 方法

2．1 获得Tibet／07-Y株基因组主要序列

2．2 病毒基因组末端cDNA的获取(RACE)

2．3 全基因组序列的测定、拼接、分析

2．4 与其他病毒株H基因序列的比较

3 结果

3．1 Tibet／07-Y株基因组主要序列扩增及测序结果

3．2 Tibet／07-Y株的3’RACE扩增及测序结果

3．3 Tibet／07-Y株的5’RACE扩增及测序结果

3．4 Tibet／07-Y株全基因组序列分析

3．5 Tibet／07-Y与其他PPRV以及麻疹病毒属其他病毒H蛋白基因的核苷酸和氨基酸序列比较

3．6 Tibet／07-Y与麻疹病毒属部分病毒H蛋白主要功能区位点的比较

4 讨论

结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的论文

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