治疗恶性脑胶质细胞瘤新方法探索研究

摘要

脑胶质细胞瘤是颅内常见恶性肿瘤，占颅内肿瘤的45％～50％，目前尚无根治方法。恶性脑胶质细胞瘤呈浸润性生长，手术无法全切，需结合放疗、化疗、生物治疗等综合治疗手段以延长病人生存期。有关恶性脑胶质细胞瘤发生、发展及治疗的研究一直是神经外科领域的热点之一。 在本研究中，我们对恶性脑胶质细胞瘤细胞中MAGE-1基因进行RNA干扰的体外实验研究，以及面包海星皂苷-1对恶性胶质细胞瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡的体外研究，探索胶质细胞瘤两种新的治疗方法。 黑色素瘤相关抗原基因-1(melanomaantigengene-1，MAGE-1)是1991年VanderBruggen等用基因克隆技术首次发现恶性黑色素瘤细胞表达的一个基因，其编码抗原MZ2-E在黑色素瘤和其它多种肿瘤中均有不同程度的表达，而在正常组织中除睾丸和胎盘外均不表达。MAGE-1作为肿瘤特异性抗原，其发现是肿瘤免疫和免疫治疗的一个重大突破，为进行肿瘤免疫治疗提供了重要的靶分子。以往的研究表明，MAGE-1作为肿瘤特异性抗原，可激活患者机体的免疫系统，活化细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)，CTL通过识别肿瘤细胞上MAGE-1抗原，能特异性地杀伤肿瘤细胞。目前，MAGE-1已应用于肿瘤治疗性疫苗的研究，其疫苗种类主要为肽疫苗和基因疫苗。多项研究表明，MAGE-1在胶质母细胞瘤中表达，正常脑组织无表达。在脑胶质细胞瘤中MAGE-1表达水平可应用于评估低级别星型细胞瘤的恶性程度，并且可预测其向间变型星形细胞瘤(Ⅲ级)和多形性胶质母细胞瘤(Ⅳ级)恶性分化的趋势。尽管MAGE-1已被发现并研究多年，但是MAGE-1的功能目前尚不明确。RNA干扰技术的出现，为MAGE-1分子功能研究提供了有利的工具。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是一种广泛存在于高等植物和动物中的由双链RNA介导的转录后基因沉寂现象。外源的双链RNA(doublestandedRNA，dsRNA)在细胞内一种被称为Dicer的核酸酶的作用下，首先被剪切成含19-23个核苷酸对的小RNA片段，称为小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)。后者与Dicer和其它一些蛋白质共同构成RNA诱导的沉寂复合物(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)，依靠碱基互补规律识别与siRNA同源的mRNA分子，并将它们降解。目前RNAi作为一种高效特异地抑制基因表达的新技术，已广泛应用于基因功能和基因治疗等研究中。在肿瘤基因治疗中，通过人工合成特定癌基因靶向的siRNA，或构建上述siRNA的表达载体，并将它们导入肿瘤细胞中，可特异性地抑制目的基因的表达。 在本研究中，我们首先利用RNA干扰技术研究MAGE-1的功能及其在恶性胶质细胞瘤基因治疗中的作用。在这部分研究中我们进行了如下工作： 1.人脑恶性胶质细胞瘤组织和细胞系中MAGE-1的表达及意义为探讨MAGE-1分子在人脑胶质细胞瘤中的表达与其恶性程度的关系，我们利用免疫组织化学SABC法检测48例人脑胶质细胞瘤标本、2株人脑胶质瘤细胞系U87MG、SHG-44及6名正常人脑组织中MAGE-1蛋白的表达。同时采用免疫荧光染色后流式细胞仪分析及荧光显微镜观察2株胶质瘤细胞MAGE-1的表达。结果显示，MAGE-1蛋白在Ⅰ-Ⅳ级胶质细胞瘤组织中阳性率分别为25.0％，29.4％，38.5％和50.0％，正常脑组织无表达。胶质瘤细胞系U87MG、SHG-44细胞MAGE-1的表达率分别为77.3％，95.8％。表明MAGE-1分子表达于人脑胶质细胞瘤细胞，并与其恶性程度相关。 2.针对MAGE-1的RNA干扰真核表达载体的构建与稳定转染U87MG细胞我们通过构建抑制MAGE-1的siRNA真核表达载体，研究其在人恶性胶质瘤细胞系U87MG细胞中对MAGE-1基因表达的干扰作用。化学合成2对编码短发夹RNA序列的靶向MAGE-1基因寡核苷酸链，克隆到经BglⅡ、HindⅢ双酶切的pSUPER载体上，重组构建RNAi质粒载体。利用RT-PCR、Western-blot、流式细胞术和荧光显微镜等技术，检测经稳定转染干涉载体后胶质瘤U87MG细胞中MAGE-1的表达，以了解siRNA的干扰效果。结果显示，重组构建的pSUPER-MAGE-1载体经双酶切、电泳及插入基因片段序列分析，表明寡核苷酸链成功插入到预计位点，并且序列与预期完全一致。pSUPER-MAGE-1载体稳定转染U87MG细胞后，G418筛选，细胞单克隆化培养，其MAGE-1的表达经RT-PCR、流式细胞术和荧光显微镜检测，2对siRNA均有较明显的干扰作用。以上结果表明，pSUPER-MAGE-1载体成功构建，并能有效抑制U87MG细胞中的MAGE-1分子的表达，为进一步研究MAGE-1在肿瘤中的作用，分析基因功能，展开胶质细胞瘤基因治疗奠定了基础。 3.针对MAGE-1的RNA干扰对恶性胶质瘤细胞系U87MG增殖及侵袭性的影响我们利用MTT、细胞周期、细胞形态学和细胞侵袭实验等技术对比研究了U87MG细胞进行MAGE-1的RNA干扰前后细胞生物学特性的改变。结果显示，针对U87MG细胞中MAGE-1分子进行的RNA干扰，导致恶性胶质细胞瘤细胞的增殖抑制；干扰后U87MG细胞形态学发生了改变，细胞体积变大，细胞饱满，呈多角形，可见伸展的突起，细胞透亮性提高，并见颗粒，核/浆比例减小；细胞周期出现了G0/G1期的阻滞；侵袭实验结果显示RNA干扰后细胞侵袭能力显著下降。实验结果表明，通过RNA干扰技术抑制恶性胶质瘤细胞系U87MG细胞中MAGE-1分子的表达，能明显降低U87MG细胞的恶性增殖及其侵袭能力，为进一步研究MAGE-1分子与恶性胶质细胞瘤的治疗奠定了一定的基础。 面包海星皂苷-1(asterosaponins1)是我国科学家对我国南海三亚海域的面包海星(Culcitanovaeguineae)进行了系统的化学活性分析，分离鉴定出7个新的海星皂苷化合物中的一个。面包海星皂苷-1对肿瘤的作用及其机理国内外尚无研究，我们利用人脑胶质母细胞瘤细胞系U87MG研究它在体外对恶性胶质细胞瘤细胞生长的影响，探索其作用机理。我们使用MTT、细胞周期分析、Hoechst33342细胞核染色荧光显微镜观察、透射电子显微镜观察、AnnexinV/PI双染法、DNAladder以及Westernblot检测Bcl-2/Bax蛋白表达水平变化等方法来了解面包海星皂苷-1对U87MG细胞的作用。实验结果显示，面包海星皂苷-1在很低的浓度(IC50=4.3μg/mL)就够引起人胶质母细胞瘤细胞系U87MG细胞的增殖抑制。当面包海星皂苷-1作用浓度为3.4μg/mL和4.3μg/mL时，U87MG细胞出现S期阻滞，而其浓度为10.0μg/mL时，U87MG细胞出现G0/G1期阻滞。同时，出现的亚二倍体峰(sub-G1)随浓度和时间而增加。Hoechst33342细胞核染色荧光显微镜观察以及透射电子显微镜下细胞形态观察显示出典型的凋亡细胞形态学特征。应用AnnexinV/PI双染法检测到较高浓度时(10.0μg/mL)面包海星皂苷-1的作用下3、6、12和24h凋亡细胞早晚期总和分别为16.9％、31.7％、52.9％和80.8％。10.0μg/mL面包海星皂苷-1作用的U87MG细胞经DNA琼脂糖凝胶电泳呈典型的凋亡梯形带。另外，随着面包海星皂苷-1作用浓度和时间的增加，U87MG细胞内Bcl-2减少，而Bax增加，出现了明显凋亡的趋势。体外实验初步显示，面包海星皂苷-1可明显抑制U87MG细胞的增殖，并促进其发生凋亡，为探索一种治疗恶性胶质细胞瘤的新药奠定了一定的基础。 以上研究表明，MAGE-1分子表达于胶质细胞瘤细胞上，并与胶质细胞瘤恶性程度相关，可能参与胶质细胞瘤细胞的增殖与侵袭，是利用RNA干扰方法进行胶质细胞瘤基因治疗的良好靶分子。另外，面包海星皂苷-1可明显促进胶质细胞瘤细胞系的凋亡，为其作为新型胶质细胞瘤化疗药物奠定理论基础。

目录

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缩略语表

前言和文献回顾

1人恶性胶质细胞瘤组织和细胞系中MAGE-1的表达及意义

2针对MAGE-1的RNA干扰真核表达载体的构建与稳定转染U87MG细胞

3针对MAGE-1的RNA干扰对恶性胶质瘤细胞系U87MG增殖及侵袭性的影响

4面包海星皂苷-1对恶性胶质瘤细胞系U87MG增殖抑制和诱导凋亡的体外研究

小 结

参考文献

附录

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致谢