辛伐他汀、甲状旁腺素相关肽（PTHrP）在破骨细胞生成和骨吸收中的作用

摘要

辛近来研究发现，他汀类药物可有效地治疗骨质疏松，降低骨折的发病率[1,2]。究其机理，多认为他汀类药物可以促进骨髓基质细胞向成骨细胞的分化，但对破骨细胞的作用目前却很少报道。 多种骨吸收性疾病，包括骨质疏松、炎症性骨病、骨转移癌、牙周疾病等，无论其致病原因如何，最终都是通过破骨细胞功能加强，破骨活动强于成骨活动而导致的。成骨细胞/骨髓基质细胞表面的RANKL基因(receptoractivatorofNF-κBLigand，核激活因子受体配体)，是破骨细胞分化和发挥功能的关键基因。RANKL与破骨细胞表面的RANK(receptoractivatorofNF-κB，核激活因子受体)结合后，刺激破骨细胞前体细胞向成熟破骨细胞分化，也刺激了成熟破骨细胞发挥骨吸收功能。骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)是RANKL的假目标受体，可以拮抗RANKL的作用。 在骨转移癌中，肿瘤细胞分泌的甲状旁腺素相关肽(Parathyroidhormone-relatedpeptide，PTHrP)，通过刺激成骨细胞/骨髓基质细胞高表达RANKL基因，促进破骨细胞的分化，加强破骨细胞的破骨活动，从而导致骨破坏。 本实验目的是研究：辛伐他汀是否能抑制PTHrP诱导的破骨细胞形成，以及其对骨髓基质细胞中RANKL及OPG的基因表达有无影响。本文从体外细胞培养，体内骨吸收模型建立等几个方面，进行研究，其主要内容是： 一.辛伐他汀对PTHrP诱导破骨细胞分化的影响PTHrP可以刺激骨髓细胞向破骨细胞分化。鼠骨髓细胞在PTHrP的刺激下培养6d，可观察到大量抗酒石酸染色阳性的破骨细胞生成。加入不同剂量的辛伐他汀培养6d后，通过对抗酒石酸染色阳性的破骨细胞计数，可以发现0.1μM的辛伐他汀就可以抑制破骨细胞的生成，10μM的辛伐他汀几乎完全抑制了破骨细胞的生成。 二.辛伐他汀对贴壁骨髓基质细胞中OPG/RANKL基因表达的影响收集骨髓细胞培养10d，每2-3d换液时轻轻吹打移去不贴壁的造血细胞，贴壁的骨髓细胞为骨髓基质细胞。传代2次后，分组用不同浓度的辛伐他汀进行干预，继续培养至贴壁细胞80％融合(3d)。提取RNA，反转录为cDNA后，采用实时荧光PCR检测OPG和RANKL基因的表达。骨髓基质细胞在辛伐他汀干预下，OPG基因表达明显上调，RANKL基因的表达明显下调，提示辛伐他汀参与骨髓基质细胞中OPG和RANKL基因的调控。 三.辛伐他汀对体外小鼠颅骨骨代谢的影响收集骨髓基质细胞分别在含有PTHrP或PTHrP+1.0μM辛伐他汀的培养液中，在放有小鼠颅盖骨的24孔培养板中进行培养8d。检测培养上清碱性磷酸酶(ALP)和钙离子含量的变化，观察小鼠颅盖骨组织学变化。结果发现：辛伐他汀体外可降低培养液中钙离子的浓度，提高碱性磷酸酶的活性，并使小鼠颅盖骨骨吸收抑制和矿化增强。 四.PTHrP诱导的局部骨吸收动物模型的建立每天皮下注射PTHrP1次，每次10μg到小鼠的左侧头皮下，分别在3d后的8h、12h、24h以及5d后的12h取材；每天皮下注射PTHrP2次，注射5d后，12h取材。进行X线片和组织学观察，在颅骨部位，均产生了不同程度的骨吸收。每天注射1次，在注射PTHrP3d后的8h和12h，骨吸收不是很明显，至24h骨吸收明显，在注射5d后，骨吸收显著；每天注射2次，5d后骨吸收最为显著。在注射PTHrP1d后的3h，3d后的3h、6h和10h，5d后的3h和10h，分别检测全血中血钙变化，发现：注射PTHrP1d后，血钙无变化；3d后血钙显著升高，维持3-6h后，在10h时，呈下降趋势；在注射PTHrP5d后的3h有明显的高钙血症，在10h后逐渐下降。这提示PTHrP诱导的高钙血症水平并不恒定，而呈波动性变化。然而，每天注射2次，则在3d和5d后的10h血钙水平下降较轻。局部骨吸收在注射3d后的24h比较明显，在注射PTHrP5d后，可以建立稳定可靠的局部骨吸收和高钙血症动物模型。 五.辛伐他汀对PTHrP体内诱导的骨吸收和高钙血症的影响，利用注射PTHrP到小鼠颅骨建立的局部骨吸收动物模型，研究在动物体内辛伐他汀是否能抑制破骨细胞活动增强所导致的骨吸收。 BALB/C小鼠每天皮下注射PTHrP2次，每次10μg/10μl，共注射5天。并于前1天，开始对实验小鼠用辛伐他汀每天灌胃一次，分30、120mg/kg两个治疗组和空白对照组，7d后取材，进行X线片测量骨吸收面积，组织学检查计算单位面积内破骨细胞数目，与对照组比较。结果发现，30mg/kg/d组和对照组比较并无差别；120mg/kg/d组骨吸收面积和单位面积内破骨细胞数目均显著高于对照组。对血钙水平的影响也只有在120mg/kg/d组有显著下降。 说明辛伐他汀对小鼠局部骨吸收和高钙血症的抑制作用，只有达到一定的剂量才能出现。结果提示在体内，大剂量的辛伐他汀可以抑制PTHrP诱导的骨吸收，并能有效地抑制高钙血症。 六.辛伐他汀对去势大鼠骨质疏松的预防性治疗去势大鼠每天辛伐他汀灌胃一次，每次10mg/kg，治疗12周，检测股骨骨密度、股骨生物力学和骨形态计量学参数，分别与去势组和正常组比较。结果发现，辛伐他汀给药组较去势组各种参数均显著改善，但与正常组比较，仍未达到正常水平。说明辛伐他汀能有效地减轻去势大鼠骨质疏松症的发生。 七.辛伐他汀对小鼠股骨干骨折愈合的影响的初步研究建立小鼠股骨干中段骨折的动物模型，分别于术后第1、8、14d开始给药，用辛伐他汀每天灌胃一次，每次120mg/kg，并分别于0、8、14和22d照X线片，22d处死取材观察组织学变化。结果发现：辛伐他汀在第0、8d开始给药，对小鼠股骨干骨折愈合有着明显促进作用。

目录

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英文缩写词表

前言

文献回顾

1 体外PTHrP和1，25-(OH)2-D3诱导小鼠破骨细胞培养体系的建立

2.辛伐他汀对PTHrP诱导的破骨细胞形成的影响

3.辛伐他汀对体外小鼠颅骨骨代谢的影响

4.辛伐他汀对骨髓基质细胞OPG/RANKL mRNA表达的影响

5.PTHrP诱导的局部骨吸收动物模型的建立

6.辛伐他汀对PTHrP体内诱导的小鼠颅骨局部骨吸收和高钙血症的影响

7.辛伐他汀对去势大鼠骨质疏松的预防性治疗作用

8.辛伐他汀对小鼠股骨干骨折愈合的初步探讨

小结

参考文献

个人简历与研究成果

致谢