转基因和基因敲入小鼠前列腺癌模型的实验研究和多价抗前列腺癌单链抗体的制备

摘要

目的：前列腺癌是男性特有的肿瘤。小鼠中没有自然发生的前列腺癌，利用基因工程技术建立小鼠前列腺癌模型对临床前期前列腺癌的研究具有至关重要的意义。最近，利用前列腺分泌性蛋白94氨基酸(PSP94)启动子建立了转基因前列腺癌小鼠模型(TGMAP)和基因敲入前列腺癌小鼠模型(KIMAP)，后者尤其显示了与人类相近的肿瘤特征。本课题利用与临床Gleason分级系统相近的小鼠组织学分级系统、流式细胞仪和基因芯片技术，分析比较了KIMAP模型与人类前列腺癌和TGMAP模型。本课题首次应用三维超声微成像监测TGMAP模型小鼠的前列腺肿瘤生长，建立小鼠前列腺癌的血清学肿瘤标志物PSP94检测系统。为了提高以往构建的抗人γ-精浆蛋白(γ-Sm)单链抗体(scFv)的亲和活性，我们应用人p53四聚功能域基因构建了四价scFv，并进行真核表达和活性测定。 方法：①依照前列腺癌临床诊断的Gleason五级10分制的组织学分级和评分标准，建立了基因工程小鼠模型的分析标准。对96例KIMAP和44例TGMAP前列腺癌标本进行了分析，并与临床前列腺癌进行了比较。对于来自KIMAP和TGMAP的肿瘤标本进行了流式细胞仪和基因芯片分析。②应用三维超声微成像系统监测了TGMAP模型小鼠的前列腺肿瘤生长。通过对TGMAP小鼠前列腺癌的三维超声图像和前列腺癌标本的连续切片定性比较，验证该超声系统检测活体小鼠肿瘤大小和形状的可靠性。③为了建立小鼠前列腺癌血清学肿瘤标志物PSP94检测系统，我们制备了抗重组小鼠PSP94的多克隆抗体，并对来自两种小鼠模型的不同组织学分级的前列腺癌标本进行了免疫组化分析。建立了竞争ELISA方法测量小鼠血清PSP94水平，并监测去势小鼠(雄激素去除治疗)的血清PSP94变化。④利用递归PCR法扩增IgG3上游铰链区与p53四聚功能域融合基因，克隆入pUC19载体中构建pUC19/IgG3/p53克隆载体。将抗γ-SmscFv克隆入该载体中，构建抗γ-SmscFv/p53四聚功能域融合基因，并克隆入真核表达载体pSecTag2-B，转染HeLa细胞表达纯化后，利用流式细胞仪进行活性测定。 结果：①来源于TGMAP(n=前列腺癌44例/总数187例)和KIMAP(n=前列腺癌96例/总数169例)的前列腺癌小鼠表现了不同的组织学评分的分布(p=0.000)。KIMAP小鼠(52.1％)比TGMAP小鼠(25.0％)表现出更高的混合组织学评分率，更接近于临床平均值(50.0％)，肿瘤浸润前列腺范围的平衡分布与年龄显著相关(p=0.001)，而TGMAP小鼠在所有年龄组均显示出不平衡的和随意的组织学评分分布。流式细胞仪分析显示多数KIMAP肿瘤为双倍体，与临床相近，而所有TGMAP肿瘤均为非整倍体。基因芯片分析证明，在KIMAP中免疫应答基因高表达，而TGMAP晚期肿瘤(26-32周)中与神经内分泌肿瘤(NE)分化相关的基因占主体，而NE肿瘤在人类前列腺癌中少于10％。多数晚期(1年)的KIMAP小鼠不进展为NE癌和小细胞癌，只在极晚期(75-92周)可见且频率低(2/36)。人类前列腺癌的几个肿瘤标记物基因在KIMAP中均可检测到(在TGMAP中缺乏)，包括hepsin、maspin、Nkx3.1、CD10和PSP94等。②通过定性比较前列腺癌的三维超声成像与连续组织学切片，证实了该超声系统可以准确显示活体小鼠肿瘤的大小和形状。超声成像可检测到直径在2.4-14mm的肿瘤。通过三维超声体内测量和尸检获得的肿瘤最大直径的相关性为0.998，超声诊断的敏感性和特异性均＞90％。通过动态超声监测结果绘制的指数生长曲线显示两只小鼠的肿瘤体积倍增时间分别为5天和13天。③在本研究中我们发现，与人类PSP94不同，小鼠PSP94是糖基化的蛋白。对KIMAP和TGMAP模型的不同组织分级肿瘤的免疫组织化学研究表明，与人类前列腺特异抗原(PSA)和PSP94相同，小鼠PSP94表达下调(p＜0.001)。用小鼠PSP94多克隆抗体亲和层析柱的方法纯化并证实小鼠血清内存在PSP94。建立竞争ELISA方法，并以1ng/ml的灵敏度定量检测血清PSP94水平。野生型小鼠PSP94血清平均水平为50.0ng/ml，对于20周龄、40周龄和＞40周龄的前列腺癌小鼠模型分别为150.0、825.5和774.8ng/ml。血清PSP94的升高与小鼠肿瘤分级有着良好的相关性(p=0.000，n=68)。通过对去势小鼠血清PSP94水平的连续监测，我们发现前列腺组织对激素的反应性/抵抗性与血清PSP94水平相关。三维超声成像进一步证实小鼠血清PSP94在激素治疗中可作为标志物。④获得了抗人γ-SmscFv/p53四聚功能域融合基因，基因全长891bp，可编码297个氨基酸。表达产物经SDS-PAGE和Western印迹实验证实为约35kD的特异蛋白条带，纯化后经流式细胞仪检测可以特异性地结合PC-3细胞，亲和力高于scFv。 结论：①由于KIMAP模型成功地模仿了人类前列腺癌特征，在前列腺癌临床前期研究中具有潜在的应用价值。②小鼠前列腺癌模型的三维超声微成像具有诸多优点，如：空间分辨率高、与软组织的对比强、操作快速简易、设备便宜可携带等，有望成为小鼠临床前期研究的新的微成像手段。③首个小鼠类前列腺癌血清学标志物的建立将会极大的方便对人类前列腺癌的基础及临床前期研究。④获得了可与PC-3细胞特异结合的四价抗γ-SmscFv，为进一步临床应用奠定基础。

目录

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缩略语表

前言和文献回顾

1 PSP基因敲入和转基因小鼠前列腺癌模型的比较研究

2小鼠前列腺癌模型的三维超声微成像

3前列腺癌小鼠模型血清肿瘤标志物的建立

4抗人γ-精浆蛋白单链抗体四聚体的构建及表达

小 结

参考文献

个人简历

攻读学位期间发表的学术论文

致谢