马铃薯卷叶病毒中国株基因组全序列及马铃薯S病毒内蒙分离株3＇端序列的分析

摘要

马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus，PLRV)和马铃薯S病毒(Potato virusS,PVS)是马铃薯上的两种重要病害。马铃薯卷叶病毒中国分离株(Potato leafroll virus-China，PLRV-CH)至今未有全序列报道，在其他分离株的全序列报道中末端序列测定结果也存在较大差异，将影响对其功能的进一步研究;而且PLRV-CH必然存在与其他分离株不同的特性，也值得进一步探究。 PVS属麝香石竹潜隐病毒，起初危害不显症状，易造成病毒积累，造成马铃薯产量长期得不到提高，再加之其与其他多种病毒有协同作用关系，也可引起较大的危害。确定马铃薯S病毒内蒙分离株(Potato virusS-Inner Mongolia，PVS-IM)的所属株系，才能更有针对性的防治病害，培育抗病品种，和评估产量损失。本研究主要结果如下: 1.本研究获得了完整的马铃薯卷叶病毒中国分离株基因全长序列5884nt。首次发现5嘬末端第一个碱基U，为VPg与核酸链的连接机制研究提供参考;进一步证明3'最末端为GU，丰富了马铃薯卷叶病毒属末端碱基为GU的证据。 2.建立了两套适用于低丰度马铃薯卷叶病毒RNA末端序列测定而且简便易行成本低效率高的体系。设计了无polyA的RNA3'末端用NH2修饰DNA Splint Primer搭桥的加尾方法。 加尾产物可直接做下游反应的模板是两体系的共同特性。新技术更可以实现PLRVRNA3'末端特异性加尾，再配合特殊温度控制的RT-PCR，在5h内即可完成实验。两体系的建立使本研究可以感染马铃薯卷叶病毒植物总RNA为模板，获得马铃薯卷叶病毒非编码区序列。 3.PLRV-CH序列在可能存在的Rap1和ORF6区域中存在特有终止子突变，但是否存在这两个蛋白还需要进一步确定。在Rap1和滑动序列区间以及5'和3'末端存在的茎环结构中茎结构保守，突变大多发生在环结构处和茎结构的非核心区域，茎结构的核心区域是通过核苷酸变异分析基因功能的首选;存在于变异区间的保守区域往往具有重要作用。 4.本研究获得了PVS-IM分离株3'端序列，经比对该分离株3'端核酸和氨基酸序列，以及外壳蛋白N端氨基酸区域表明属于PVSO株系;还发现亚基因组增强子区域也具有区分两株系的区别。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 马铃薯卷叶病毒和马铃薯S病毒的危害

1．1．1 马铃薯的重要地位

1．1．2 病毒病是马铃薯种性下降的主要原因

1．1．3 马铃薯卷叶病毒和马铃薯S病毒是马铃薯生产中较重要的病毒

1．1．4 病毒间的协同作用

1．2 马铃薯卷叶病毒的分子生物学

1．2．1 生物学特性

1．2．2 分类学

1．2．3 基因组结构

1．2．4 基因的表达机制

1．2．5 基因功能

1．2．6 复制机制

1．2．7 基因组稳定性、变异性、致病性

1．2．8 马铃薯抗卷叶病毒基因工程研究

1．3 马铃薯S病毒分子生物学

1．3．1 生物学特性

1．3．2 分类学

1．3．3 基因组结构和功能

1．3．4 PVSO(Ordinary)和PVSA(Andean)两株系的区分

1．3．5 马铃薯抗S病毒的基因工程研究

1．4 末端序列测定方法

1．4．1 基于模板转换(Template switching)获得全长cDNA

1．4．2 基于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)加尾获得末端序列

1．4．3 基于T4RNA连接酶实现分子内环化或分子间连接获得全长cDNA

1．4．4 基于PolyA聚合酶给末端无PolyA结构的RNA加A尾获得全长cDNA

1．4．5 基于T4 DNA ligase的RNA tagging方法获得全长序列

1．4．6 基于DNA Splint实现两单链间的连接

1．5 研究的目的意义与主要研究内容

1．5．1 目的与意义

1．5．2 主要研究内容

第二章 马铃薯卷叶病毒近全长序列的分析

2．1 材料与方法

2．1．1 毒源与总RNA提取

2．1．2 RNA质量检测

2．1．3 引物设计

2．1．4 RT-PCR

2．1．5 克隆

2．1．6 测序和序列分析

2．2 结果与分析

2．2．1 PLRV RNA提取

2．2．2 RT-PCR结果

2．2．3 PLRV序列分析

2．2．4 ORF1序列分析

2．2．5 全序列结构分析

2．3 结论与讨论

2．3．1 ORF1分析结论

2．3．2 马铃薯卷叶病毒结构分析

第三章 马铃薯卷叶病毒5’非编码区结构分析

3．1 材料与方法

3．1．1 引物设计

3．1．2 毒源与总RNA提取

3．1．3 反转录反应

3．1．4 降解RNA回收cDNA

3．1．5 TdT加尾反应

3．1．6 Tailing-cDNA直接PCR

3．1．7 克隆和测序

3．1．8 PLRV 5’UTR序列分析

3．2 结果与分析

3．2．1 PLRV RNA提取

3．2．2 TdT加尾体系的优化及加尾产物直接PCR结果

3．2．3 载体连接及序列测定

3．2．4 PLRV 5’UTR序列分析

3．3 结论与讨论

3．3．1 对TdT加尾技术的改进

3．3．2 PLRV-CH 5’UTR最末端可能为尿嘧啶核苷酸U

第四章 马铃薯卷叶病毒3’端结构分析

4．1 材料与方法

4．1．1 引物设计

4．1．2 PLRV RNA样品

4．1．3 3’末端序列测定

4．1．4 克隆和序列分析

4．2 结果与分析

4．2．1 PLRV-CH RNA提取

4．2．2 3’末端序列测定

4．2．3 3’UTR序列的基本分析

4．3 结论与讨论

第五章 马铃薯S病毒内蒙分离株3’端序列的测定和分析

5．1 材料与方法

5．1．1 毒源与总RNA提取

5．1．2 3’RACE引物设计

5．1．3 3’RACE

5．1．4 序列分析

5．2 结果与分析

5．2．1 RNA提取结果

5．2．2 3’RACE电泳检测

5．2．3 载体连接及序列测定

5．2．4 序列比对

5．3 讨论

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

导师组意见

致谢

作者简历

硕士期间发表论文