高脂饲养大鼠甘油三酯异位沉积与胰岛素抵抗的关系

摘要

研究背景: 　近年来由于人们生活水平的提高、生活方式的改变、人口老龄化及肥胖等因素，T2DM的发病率在全球范围内呈逐年增加的趋势。大量流行病学资料显示肥胖与T2DM发病有密切的关系。2001年，班廷奖得主McGarry教授在美国糖尿病协会年（ADA）上提出脂代谢障碍为T2DM及其并发症的原发病理生理改变，2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）中糖代谢紊乱的根源为脂代谢异常，并提出“糖尿病是糖脂病（diabetes mellipitus）”的新概念。早在六十年代，研究人员就注意到游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)对葡萄糖代谢的影响，Randle等人在大量实验的基础上提出葡萄糖－脂肪酸循环（glucose-fatty acid cycle，Randle循环）的假说。九十年代，Grill等学者发现慢性FFA水平升高及胰岛β细胞内脂质沉积可导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS ) 障碍，胰岛细胞出现脂性凋亡，再生能力减弱，从而提出“脂毒性”的概念。随着研究的深入，研究人员发现脂质在骨骼肌、肝脏等非脂肪组织内的沉积以及肥大的脂肪细胞产生的大量脂肪细胞因子与IR的发生密切相关。 “脂毒性”指FFA产生过多，超过组织氧化能力，FFA在非脂肪组织再酯化为TG，过多的TG沉积可以导致和加剧IR和β功能障碍。肝细胞内TG增多导致肝胰岛素与胰岛素受体结合减少、高胰岛素血症、糖耐量减低，引起肝脏IR；而骨骼肌细胞内TG增高导致葡萄糖的摄取和利用降低，引起骨骼肌IR。研究发现：一方面，人类骨骼肌IR与二酰基甘油(DAG)含量增加、蛋白激酶C(PKC)活性增高有关，并且与胰岛素受体、IRS－1磷酸化增加导致的细胞内信号传导减弱有关。另一方面，血浆FFA长期持续升高使组织脂酰CoA 酯化为TG增多，导致细胞内TG沉积，β细胞内TG过度沉积引起β细胞GSIS障碍，β细胞凋亡增加，细胞数量减少[7]。其机制可能是血浆FFA升高导致细胞内脂酰CoA 升高,进而促进软脂酰CoA及神经酰胺生成增多，神经酰胺可通过活化核因子κB(NF-κB) 上调iNOS ,使NO合成增加,NO源性的自由基生成增多,引起β细胞凋亡。但有研究认为, 胰岛素抵抗可能通过减弱和/或损伤胰岛素对脂肪代谢的调节作用，导致血浆游离脂肪酸增加，进而促进肝脏脂肪变性。有关FFA代谢障碍和TG异位沉积与IR之间的关系还不是十分清楚。故本研究拟利用高脂饲养SD大鼠，观察大鼠胰岛素抵抗发生早期阶段，血浆FFA，肝脏、骨骼肌和胰腺TG沉积变化特征，以期阐明血浆FFA、肝脏、骨骼肌和胰腺TG沉积与胰岛素抵抗之间的关系。 目的: 以高脂饲料饲养SD大鼠，观察大鼠空腹血浆胰岛素和FFA水平，利用油红O脂肪染色方法观察大鼠肝脏、骨骼肌和胰腺组织甘油三酯沉积情况，探讨高脂饲养大鼠血浆FFA水平和TG在肝脏、骨骼肌及胰腺沉积与IR发生的关系。 方法: 健康雄性9周龄SD大鼠60只，随机分为高脂饲料饲养的实验组和普通饲料饲养的对照组，每组30只。再随机将实验组和对照组大鼠分为2周、4周和6周组，每组各10只。饲养过程中不限制大鼠饮食，两组大鼠分别在实验的第2周末、4周末和6周末处死。处死前12小时禁食，测量体重后采取尾部末梢血样约1.0mL。采血后测定血糖，剩余血样离心，上清液于－70℃冰箱保存，放射免疫法检测血浆胰岛素，铜显色法检测FFA。采血后处死动物，分别取实验组和对照组动物肝脏、骨骼肌和胰腺，冰冻切片，进行油红O染色标染脂肪。比较两组大鼠血浆空腹游离脂肪酸（FFA）、血浆胰岛素（FINS）、空腹血糖（FBG）、肝脏、骨骼肌及胰腺TG 异位沉积的情况及胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），探讨血浆FFA、肝脏、骨骼肌和胰腺TG沉积与胰岛素抵抗之间的关系。 主要实验结果: 1．血糖、血浆胰岛素、胰岛素抵抗指数变化特点实验2周组、4周组和6周组空腹血糖分别为5.14±0.41、5.20±0.47、5.32±0.54，与对照组（5.12±0.25、5.14±0.31、5.12±0.46）比较无明显差别（P >0.05）。实验2周组FINS为13.60±2.07，与对照2周组比较无明显差别（12.02±1.37,P >0.05）；实验4周组FINS为25.05±2.95，与对照组比较明显升高（12.57±1.20,P <0.01）;实验6周组FINS为31.96±2.57，与对照组比较明显升高（12.64±1.35, P <0.01）。实验2周组胰岛素抵抗指数为3.12±0.63，与对照2周组比较无明显差别（2.73±0.35,P >0.05）；实验4周组为5.81±0.97，比对照组比较明显升高（2.87±0.29,P <0.01）。实验6周组胰岛素抵抗指数为7.56±1.12，与对照组比较明显升高（2.86±0.34, P <0.01）。 2．血浆FFA的浓度变化特点实验2周组FFA为0.60±0.02，与对照2周组无明显差别（0.57±0.03,P >0.05）；实验4周组FFA为0.68±0.03，与对照4周组比较明显升高（0.60±0.04,P <0.01）;实验6周组FFA为0.74±0.04，与对照组比较明显升高（0.62±0.05, P <0.01）。以高脂2周组、4周组和6周组空腹血浆FFA和FINS进行线性相关分析显示二者呈明显的正相关关系（r＝0.617，P <0.01），以高脂2周组、4周组和6周组空腹血浆FFA和胰岛素抵抗指数之间进行线性相关分析显示二者呈明显的正相关关系（r＝0.694，P <0.01），说明空腹血浆FFA与胰岛素抵抗密切相关。 3.肝脏、骨骼肌和胰腺油红染色和灰度分析结果实验2周组肝脏细胞未见脂滴形成，计算机半定量灰度分析值为151.0±5.20，与对照2周组比较无明显差别（153.10±4.16，P >0.05）；实验4周组肝脏细胞有大量脂滴分布，灰度分析值为113.75±6.52，与对照4周组比较差异显著（140.65±5.12,P <0.01）；实验6周组肝脏细胞脂滴非常明显，灰度分值为99.50±4.67，与对照6周组比较差异显著（128.5±3.96,P <0.01）。实验2周组肌细胞无明显脂滴存在，灰度分析值为154.05±3.52，与对照2周组比较无明显差别（155.00±5.6，P >0.05）；实验4周组肌细胞脂滴明显增加，灰度值为131.92±3.42，与对照4周组比较差异显著（139.39±2.3，P <0.01）；实验6周组肌细胞脂滴明显增加，灰度分析结果为127.60±3.10，与对照6周组比较差异显著（134.70±2.98，P <0.01）。实验2周组、4周组和6周组胰腺油红O染色切片未见脂滴，灰度分析值分别为162.64±3.58、161.72±1.23、162.30±1.60，与对照各组（163.01±2.84、163.08±2.97、161.21±1.50）比较无明显差别（P >0.05）。 4.油红O染色切片灰度分析值与FINS相关性分析以高脂2周组、4周组和6周组肝脏染色灰度值和FINS之间进行线性相关分析呈明显的负相关关系（r＝－0.882，P <0.01），由于TG沉积量越多，灰度值越小，显示肝脏TG含量与FINS呈正相关。以高脂2周组、4周组和6周组骨骼肌染色灰度值和FINS之间进行线性相关分析呈明显的负相关关系（r＝－0.891，P <0.01），显示肌细胞TG含量与FINS呈正相关，说明TG沉积与FINS水平升高密切相关。 5.油红O染色切片灰度分析值与FFA相关性分析以高脂2周组、4周组和6周组肝脏染色灰度值和FFA之间进行线性相关分析呈明显的负相关关系（r＝－0.753，P <0.01），显示肝脏TG含量与FFA呈正相关。以高脂2周组、4周组和6周组骨骼肌染色灰度值和FFA之间进行线性相关分析呈明显的负相关关系（r＝－0.736，P <0.01），显示肌细胞TG含量与FFA呈正相关,说明TG沉积与空腹FFA水平升高密切相关。 结论: 1 高脂饲料饲养大鼠4周后可导致空腹血浆FFA和空腹血浆胰岛素水平明显升高，并且提示空腹血浆FFA水平升高与空腹血浆胰岛素升高密切相关。 2. 高脂饲养4周组和6周组大鼠肝脏和骨骼肌组织TG沉积明显增多，并与空腹血浆FFA和空腹血浆胰岛素水平呈正相关，提示肝脏和骨骼肌TG沉积可能参与高脂饲养早期阶段大鼠IR的形成，而胰岛细胞中无TG沉积，故提示胰岛细胞中TG沉积可能不参与高脂饲养早期阶段大鼠IR的形成。 综上所述，高脂饲养可以诱导大鼠胰岛素抵抗形成，其IR的形成与空腹血浆FFA水平的增高及肝脏和骨骼肌组织TG异位沉积相关。