双缓释壳聚糖温敏凝胶的制备及用于牙周组织再生的实验研究

摘要

背景：牙周病是导致成年人失牙的主要原因之一，严重影响人类的身体健康和生活质量。如何使已破坏的牙周支持组织重新修复再生是牙周病治疗中的难点和热点。目前广泛开展的牙周骨移植、引导组织再生、引导骨再生等技术因植入材料缺乏主动诱导组织再生修复的能力，从而未能达到理想的牙周组织再生目标；外源性生长因子的应用具有激发牙周组织修复潜能的明确作用，但是，如何使生长因子持续高效发挥作用还未很好解决，从而使得外源性生长因子的应用受到限制。此外，牙周再生手术操作空间狭小、视野受限，复杂的操作通常难以进行，这与大量的牙周组织再生需求反差强烈。还有，由于牙周组织所处的口腔环境因素，牙周再生手术术后易受污染而影响手术效果甚至导致手术失败。 研究目的 本研究尝试将最近几年才被提出的新型载药系统壳聚糖温敏凝胶，结合环糊精包合技术，制备成能够同时缓释生长因子（rhBMP-2）和抑菌成分（氯己定）的载药凝胶，应用于牙周组织的修复再生。该载药系统的特点是保存条件下以溶液状态存在，并保持生理中性，当温度达到37℃时立即发生相转变，形成半固体凝胶。通过实验，希望获得具备生长因子和抑菌剂双缓释的功能性温敏凝胶，并通过使用该凝胶系统获得操作简便并且术后感染率低、组织修复再生效果好的牙周组织再生方法。 方法与结果 1．壳聚糖温敏凝胶的制备与性能 用不同浓度的壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液制备温敏凝胶，测量其在37℃时胶凝的时间，优选制备工艺，通过软固体测量仪、旋转粘度仪、扫描电镜以及高效液相技术等测量凝胶的强度、稳定性、降解性、体外释放骨形态发生蛋白替代物以及体外释放氯己定的效能，并通过细胞实验观察壳聚糖温敏凝胶与牙周膜细胞的相容性。 结果显示，2％壳聚糖（脱乙酰度为91％）与12％的β-甘油磷酸钠配置时获得了性状良好的壳聚糖-甘油磷酸钠温敏凝胶系统。溶液pH值为7.11±0.03，在37℃条件下，溶液经8min转变为稳定的半固体凝胶。凝胶强度为（4.6±0.3）×104 Pa，接近于1.5％琼脂糖凝胶。在凝胶中加载骨形态发生蛋白的操作简便，凝胶对蛋白具有较好的缓释效能，缓释作用长达一月以上。凝胶内直接加载氯己定不能获得氯己定的缓释，氯己定在10余小时即释放完毕。细胞实验表明，体外培养的人牙周膜细胞可以方便的加载于凝胶中，并在其中伸展，显示壳聚糖温敏凝胶有较好的细胞相容性。 2．双缓释壳聚糖温敏凝胶的制备及性能 通过饱和水溶液法制备β-环糊精与氯己定的包合物，并通过扫描电镜、红外光谱扫描、紫外光谱扫描鉴定包合物的性质。在此基础上，共混包合物以及骨形态发生蛋白替代物于壳聚糖温敏凝胶中，对比检测加载包合物前后凝胶的胶凝特性、稳定性以及在同一体系内对氯己定和骨形态发生蛋白替代物的缓释效能。 结果显示：通过鉴定，成功获得β-环糊精与氯己定的包合物。包合率为40.11％。目标药物共混于壳聚糖温敏凝胶之后，凝胶系统仍然能够在37℃时形成稳定凝胶，对蛋白药物的缓释效能未发生变化，而对氯己定的缓释作用明显增强，缓释时间长达一月以上。 3．双缓释壳聚糖温敏凝胶用于牙周组织再生的实验研究 制备犬前磨牙Ⅱ度根分叉牙周组织缺损模型，先行严密缝合组织瓣，然后分五组于牙周组织缺损处分别注入①加载氯己定/β-环糊精包合物和rhBMP-2的壳聚糖温敏凝胶（T1组）②加载rhBMP-2的壳聚糖温敏凝胶（T2组）③加载氯己定/β-环糊精包合物的壳聚糖温敏凝胶（T3组）④单纯壳聚糖温敏凝胶（C1组）⑤不注射任何药物（C0组）。术后不使用抗生素，常规护理，8w后对实验犬进行插管灌注固定，取材，大体及组织学切片观察牙龈炎症情况及牙周缺损处的组织再生情况。 结果显示：应用壳聚糖温敏凝胶，可以方便地通过注射方式局部安放载体。而且，T1组、T2组获得明显的牙周组织再生；牙龈炎症细胞浸润情况显示T1组及T3组炎细胞数量明显少于其他组。而且，T1组较T2和T3组有更好的组织再生结果。表明壳聚糖温敏凝胶作为载体在用于牙周组织缺损的再生治疗时有效发挥了rhBMP-2和氯己定各自的作用。初步证明，rhBMP-2和氯己定双缓释壳聚糖温敏凝胶用于牙周组织再生治疗具有简便性和有效性，而且，双缓释rhBMP-2和氯己定较仅缓释其中一种促进组织再生的效果更好。 4．壳聚糖化学固载环糊精新材料的研究 通过化学合成方法，将环糊精分子化学结合到壳聚糖分子的羟基（保留壳聚糖分子的氨基）上，制备壳聚糖固载环糊精的新材料，旨在获得更好的双缓释载体材料。通过红外光谱分析及核磁共振分析进行新材料鉴定。 结果：合成的新材料为淡黄色固体粉末，红外测定结果与核磁共振谱测定结果表明，环糊精分子固载于壳聚糖的羟基上，β-环糊精表观固载量经测定为42％。合成反应总收率为29％。新材料兼有壳聚糖和β-环糊精的双重结构及特性，可望成为新型双缓释载体材料应用于生物材料领域。 结论 1．通过共混rhBMP-2和氯己定/β-环糊精包合物可以获得rhBMP-2与氯己定双缓释的壳聚糖温敏凝胶，该系统在4℃条件下呈稳定的溶液状态，37℃时经8min转化成半固体凝胶，缓释rhBMP-2与氯己定一月以上，与牙周膜细胞相容，可生物降解，应用于根分叉牙周组织缺损的再生治疗，可以充分发挥rhBMP-2与氯己定各自的作用从而明显获得牙周组织再生，并能简化手术操作、控制术后感染。该系统可有效应用于牙周组织再生。 2．通过化学合成，获得壳聚糖固载环糊精新材料，有望成为更好的双缓释载体材料。