AEP多克隆抗体制备及rAAV/AEP表达检测

摘要

研究背景 全蝎具有祛风止痉的作用，为历代中医用来治疗惊厥、癫痫的首选药物，全蝎的药效在于蝎尾中的毒液组分，国内多位学者以全蝎粗毒治疗癫痫大鼠，取得了满意的效果。蝎尾中的抗癫痫有效成分为抗癫痫肽(anti-epilepsy peptide, AEP)，该成分已经由国内学者成功分离并测序，经癫痫大鼠模型验证了其活性，疗效确切。 腺相关病毒（AAV）载体可将外源基因导入动物或人体内，且无对机体的致病性。本课题组王宗仁教授等已成功地由东亚全蝎蝎尾毒腺中获取了AEP基因序列，并将该序列克隆入AAV载体，构建了重组抗癫痫肽腺伴随病毒(rAAV/AEP)载体，此工作为癫痫的基因治疗提供了新的可能。但AEP为相对分子量8.3kDa的多肽，目前尚无简便可靠的相关检测手段，AEP的抗体研究也未有报道。如果能够成功制备AEP相关抗体，我们就可以获得一种特异有效的检测AEP的方法，从而，可以进一步验证rAAV/AEP的表达情况，为进一步的rAAV/AEP有效性研究打下实验基础。 实验方法 1 构建融合表达载体，进行蛋白表：从克隆载体质粒pGEM-T/AEP中双酶切，得到AEP 片段；通过中间载体puc18，转换多克隆位点；最后将AEP 基因克隆入表达载体pGEX-4T-1 质粒中，构建融合表达载体pGEX-4T-1/AEP；转化感受态大肠杆菌DH5α，经异丙基-β-D 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，获得GST-AEP 融合蛋白；SDS-PAGE 分析表达产物，确定蛋白质高表达条件。 2 蛋白可溶性分析，纯化，定量：超声裂解法及SDS-PAGE 鉴定蛋白可容性，融合蛋白包涵体经过洗涤、变性、复性后，通过12％SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色，再次进行可溶性分析，凝胶薄层扫描检测其纯度，透析管进一步纯化蛋白，BCA 法蛋白定量。 3 制备融合蛋白的多克隆抗体： IPTG 诱导重组大肠杆菌DH5α表达GST-AEP 融合蛋白，以融合蛋白免疫家兔，获得GST-AEP 多克隆抗体，western-blot 法进行抗体鉴定，ELISA 法测定抗体效价，western-blot检定多抗敏感度。 4 检测rAAV/AEP 的表达：以rAAV/AEP 感染293 细胞，蛋白浓缩后，western-blot 检测无血清培养基上清中的AEP 表达情况；以rAAV/AEP 肌肉注射方式进行大鼠活体给药，第21 天采血，第29 天采血及注射点组织，western-blot 检测血清中AEP 的表达，RT－PCR 检测AEP 序列整合情况。 实验结果：成功构建了融合蛋白表达载体pGEX-4T-1/AEP，确定了蛋白高表达条件为37℃,5h，IPTG 终浓度为4mmol/L；所获取的融合蛋白以包涵体形式存在，经尿素变性再复性后蛋白可溶，进一步纯化，定量约0.163μg/μl；以含有融合蛋白的凝胶悬液免疫家兔后，成功获得了多克隆抗体，抗体效价为1：12000，检测敏感度为0.065μg；western-blot法可以检测到无血清培养基上清中存在AEP，注射点组织RT－PCR 证实AEP 序列已成功整合入大鼠肌细胞的基因组中，但于大鼠血清中未检测到AEP 的表达。 结论：本研究以原核表达的方式，获得了融合表达的GST-AEP，成功制备和鉴定了相关多克隆抗体，初步证实了rAAV/AEP 的表达活性。在动物整体未能检测到AEP 的表达，可能与分泌入血清中的AEP 浓度较低有关。