烟草hsr203J启动子驱动花生几丁质酶基因植物表达载体的构建及其转化花生的研究

摘要

本研究克隆了烟草诱导型启动子hsr203J及花生几丁质酶基因（Ah-chi）全长cDNA序列。将hsr203J替换掉pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，用Ah-chi替换掉pCAMBIA1301上的GUS基因，构建了hsr203J启动子驱动的Ah-chi的植物表达载体。分别通过农杆菌介导法和花粉管注射法转化花生，获得了转基因植株，PCR扩增结果表明hsr203J及Ah-chi均已成功导入到花生中。主要研究结果如下:
　　 1.从烟草中克隆得到病原物诱导型启动子hsr203J，该片段大小为1153bp，与GenBank中已注册的序列（序列号:X77136）同源性为99.83％，虽有3个碱基的突变，但突变均未发生在启动子序列的关键调控活性区域。
　　 2.提取花生叶片总RNA，根据GenBank中已注册的序列（序列号:X82330）设计特异引物扩增得到花生几丁质酶基因全长cDNA，经测序分析知该片段长899bp，与GenBank中已注册序列同源性为100％，该序列已在GenBank上登记(HQ439775)。
　　 3.将hsr203J替换掉pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，用Ah-chi替换掉pCAMBIA1301上的GUS基因，分别成功构建了植物表达载体pCAMBIA1301-hsr203J、pCAMBIA1301-Chi和pCAMBIA1301-hsr203J-Chi。
　　 4.用农杆菌介导法和花粉管注射法将各表达载体转化花生，均获得了分别含pCAMBIA1301-hsr203J和pCAMBIA1301-Ci的抗性植株，PCR扩增结果表明目的基因均已转入花生。

目录

摘要

主要英文缩略词表

1 文献综述

1．1 花生基因工程研究的意义

1．2 植物启动子研究进展

1．2．1 植物基因启动子核心结构及其功能

1．2．2 植物启动子的类型以及在基因工程中的应用

1．2．3 启动子效率的检测及活性比较

1．2．4 病原物诱导型启动子在花生分子育种研究上的意义

1．3 几丁质酶基因及其在植物基因工程中的应用

1．3．1 几丁质基因的作用机理及研究进展

1．3．2 几丁质酶在转基因上的应用

1．4 花生遗传转化方法的研究

1．4．1 农杆菌介导法

1．4．2 基因枪法

1．4．3 电击法

1．4．4 介导法

1．4．5 花粉管通道法

1．5 本研究的目的意义

2 烟草hsr203J启动子和Ah-chi全长cDNA的克隆

2．1 试验材料

2．1．1 菌种及植物材料

2．1．2 载体

2．1．3 酶与化学试剂

2．2 试验方法

2．2．1 目的基因的PCR扩增

2．2．2 目的基因的TA克隆

2．2．3 重组质粒的鉴定

2．2．4 DNA测序

2．3 结果与分析

2．3．1 烟草hsr203J启动子及Ah-chi全长cDNA PCR扩增结果

2．3．2 重组质粒的PCR和双酶切鉴定

2．3．3 测序

3 植物表达载体的构建

3．1 试验材料

3．1．1 菌株与载体

3．1．2 酶和试剂

3．2 试验方法

3．2．1 中间载体pCAMBIA1301-hsr203J和pCAMBIA1301-Chi的构建

3．2．2 植物表达载体pCAMBIA1301-hsr203J-Chi的构建

3．2．3 将各种表达载体转入农杆菌

3．3 结果与分析

3．3．1 中间载体pCAMBIA1301-hsr203J的鉴定

3．3．2 中间载体pCAMBIA1301-Chi的鉴定

3．3．3 植物表达载体pCAMBIA1301-hsr203J-Chi的鉴定

3．3．4 各载体转入农杆菌的验证

4 花生遗传转化

4．1 农杆菌介导的花生遗传转化

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．1．3 结果与分析

4．2 花粉管注射法对花生的遗传转化研究

4．2．1 试验材料

4．2．2 试验方法

4．2．3 结果与分析

5 讨论

5．1 关于病原菌诱导型启动子

5．2 关于农杆菌介导法

5．2．1 预培养时间的影响

5．2．2 侵染时间对转化的影响

5．2．3 共培养时间对转化的影响

5．3 关于花粉管注射法

5．4 后续工作思路

6 结论

参考文献

致谢

发表的论文

附录

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