首先被氨甲酰化攻击的晶状体蛋白的分离与鉴定及氨甲酰化诱导的酶失活

摘要

目的：
　　通过分离鉴定首先被氨甲酰化攻击的晶状体蛋白质及观察氨甲酰化诱导的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和硫醇转移酶（TTase）的失活，来探讨氨甲酰化在白内障发病机制中的作用。
　　方法：
　　6只透明新鲜的晶状体取自2周岁健康牛。取其中4只晶状体分为2组，与100mM氰酸钾于37℃°C水孵箱分别振动温育7天和12天。其余2只晶状体设为正常对照组。所有晶状体孵育在50mM DMEM液中，然后每只晶状体去囊膜，匀浆，提取水溶性蛋白质。采用双向凝胶电泳进行蛋白质分离。对比分析氨甲酰化组和正常对照组蛋白质表达的差异。切取凝胶上的蛋白质斑点，进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)。经质谱分析所得到的多肽峰值经SWISS-PROT数据库查询，以确定早期被氨甲酰化攻击的晶状体蛋白质，并试图找到氨甲酰化与晶状体蛋白质结合的位点。用分光光度计分别测量不同组间GAPDH和TTase的活性。
　　结果：
　　1.双向凝胶电泳结果显示大部分蛋白质斑点集中在pI5-8，相对分子量20-35kDa。氨甲酰化孵育7天组电泳图上斑点明显增多，呈串珠样改变，向阳极端迁移。质谱分析结果表明被氨甲酰化修饰的基团发生在αA-，βB2-和βS-(γS-)晶状体蛋白质。
　　2.与氰酸钾孵育后 GAPDH的活性与正常对照组相比显著降低（P<0.01），其中12天组与7天组相比，活性明显下降。TTase的活性在孵育7天后与对照组相比有统计学差异（P=0.02881），12天组的活性与对照组相比，有显著差异（P<0.01），7天组活性与12天组相比无统计学差异（P=0.19296）。
　　结论：
　　1.双向凝胶电泳和质谱分析技术可以较好地应用在首先被氨甲酰化攻击的晶状体蛋白质的分离和鉴定实验中。通过质谱分析首次证实了容易被氨甲酰化攻击的αA-，βB2-和βS-(γS-)这三种晶状体蛋白质和赖氨酸结合位点。
　　2.氨甲酰化可以诱导GAPDH和TTase酶的失活，为我们进一步预防和治疗白内障的研究提供了新思路。
　　创新点：
　　1.通过双向凝胶电泳、质谱分析等实验手段，首次分离鉴定早期被氨甲酰化攻击的晶状体蛋白，及氨甲酰化与晶状体蛋白分子结合的位点。
　　2.首次报道氨甲酰化诱导3-磷酸甘油醛脱氢酶和硫醇转移酶的失活，探讨了氨甲酰化作用与白内障发病的关系。

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缩 略 语 表

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前言

文 献 回 顾

一、翻译后修饰与白内障的发病机制的关系

二、3-磷酸甘油醛脱氢酶和和硫醇转移酶在白内障中的研究

三、氨甲酰化作用与白内障发病的关系

实 验 部 分

实验材料与仪器设备

实 验 方 法

实 验 结 果

讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢