标记MMPs阳性细胞的光学成像新方法在肿瘤细胞侵袭和转移活性评价中的应用

摘要

对正常组织的侵袭和转移是恶性肿瘤的两大特征。肿瘤细胞对周围组织的侵袭程度和是否容易发生转移是肿瘤恶性程度的重要标志。并且是肿瘤导致病人死亡的主要原因。基质金属蛋白酶（MMPs）是降解细胞外基质中各种蛋白质成分以及破坏组织重塑的特异性内肽酶类，能够破坏组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。基质金属蛋白酶2（MMP2）和膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）作为基质金属蛋白酶中最重要的两种酶和肿瘤的侵袭、转移和血管形成紧密相关。在各种肿瘤中，MMP2常以无活性的酶原形式（proMMP）过表达，经过MT1-MMP的蛋白裂解作用，proMMP活化成成熟的MMP2。因此，构建一个可评价MMP2和MT1-MMP的蛋白水解活性的分子成像策略将有助于预测肿瘤的恶性程度。
　　目的：构建一个可评价肿瘤的MMP2和MT1-MMP的蛋白水解活性（代表肿瘤的恶性程度）的分子成像系统，并对其进行效果评价。
　　方法和结果：1、在本研究中，通过基因重组、转化、扩增和纯化质粒，我们首先构建了一个全新的基于蛋白质水平的荧光探针，它可以特异性地标记在MMP2和MT1-MMP阳性的细胞表面上。此探针由4个结构域构成：①谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白结构域，也被称为抑制结构域(Inhibitory[I]-domain)，它可以抑制TM-结构域的跨膜活性。②MMP2和MT1-MMP的特异性多肽底物，也被称为分裂结构域（Cleaved[C]-domain），它是MMP2和MT1-MMP蛋白裂解探针的酶切位点。③表皮生长因子受体跨膜区，也称跨膜结构域（Transmembrane[TM]-domain），以跨膜形式有效结合在MMP2和MT1-MMP阳性细胞的细胞膜上。④DsRed2红色荧光蛋白结构域（Fluorescent[F]-domain）。
　　2、为证实构建的探针是否可以鉴别细胞的MMPs活性，我们从离体和在体两个方面进行了验证。离体实验中，人纤维肉瘤细胞HT1080（高表达MT1-MMP和MMP2）和荧光探针（10μg/mL）共同培养24小时，同时加入或不加入10μg/mLGM6001（MMPs的抑制剂），PBS洗净，荧光显微镜观察，同时测定细胞膜表面的荧光强度。结果表现为：①荧光显微镜下，GM6001(+)组HT1080细胞无可见红色荧光，而GM6001(-)组HT1080细胞发射出强红色荧光。②荧光强度的定量试验中，GM6001(-)组细胞的荧光强度为GM6001(+)组细胞荧光强度的23.3倍。此定性和定量结果说明：在MMP2和MT1-MMP作用下（GM6001(-)组），荧光探针的Cdomian发生蛋白水解，探针被分裂为两部分，释放的TM-F片段经由跨膜区（TM-domain）结合于HT1080细胞的细胞膜的表面，HT1080细胞释放红色荧光（DsRed2）；而在MMP2和MT1-MMP活性被抑制时（GM6001(+)组），荧光探针C-结构域的蛋白水解作用被抑制，探针保持完整，探针的跨膜区活性被抑制，故在荧光显微镜下，细胞表面无可测红色荧光。
　　3、在体实验，①HT1080细胞的皮下荷瘤小鼠模型的构建：注射1×106（在100μlPBS中）个对数生长期的HT1080单细胞悬液至BALB/cnu/nu免疫缺陷小鼠右后肢皮下，待肿瘤长至150mm3时备用。尾静脉注射10nmol纯化探针至此HT1080细胞皮下荷瘤小鼠，利用IVIS-200实时光学成像系统，在探针注射后0、12、24小时检测小鼠全身的荧光强度。结果表现为：注射后0h，小鼠全身都发射出荧光，接着，这些荧光强度显著下降直至消失；但是，在移植瘤部位从注射后0h直至注射后24h依然可以检测到荧光发射。这一结果说明：在移植瘤上，探针被劈开为两个片段，并且以MMPs依赖性的方式保留在移植瘤中。②MT1-MMP阳性和MT1-MMP阴性细胞的皮下荷瘤小鼠模型的建立：分别注射1×107（在100μlPBS中）个对数生长期的MT1-MMP阳性和MT1-MMP阴性细胞的单细胞悬液至BALB/cnu/nu免疫缺陷小鼠右后肢皮下，待肿瘤长至150mm3时备用。静脉注射10nmol的探针至小鼠体内，注射后24小时显像，结果为：MT1-MMP（+）组小鼠的移植瘤的单位体积荧光强度为83000光子/mm3，而MT1-MMP（-）组小鼠的移植瘤的单位体积荧光强度仅为9100光子/mm3。这一结果进一步说明探针在MMPs存在下，探针被激活并发射荧光。③笔者进一步在肿瘤的微环境水平上（利用OV-100在体光学实时成像系统）检测HeLa细胞的皮内荷瘤小鼠模型中移植瘤的浸润前沿上DsRed2的表达。HeLa细胞皮内荷瘤小鼠模型的构建：注射1×103（在100μlPBS）个处于对数生长期的HeLa单细胞悬液至BALB/cnu/nu免疫缺陷小鼠右腹侧皮内，待肿瘤长至300mm3备用。静脉注射10nmol探针至小鼠体内，OV-100光学成像系统实时观察。结果表现为：在高表达MMP2的肿瘤侵润前沿，DsRed2高表达，且在高表达MMP2的肿瘤的血管形成区域，DsRed2亦高表达。这一结果进一步证实此探针可以成功鉴别细胞的MMPs活性。
　　结论：综合以上实验，本研究成功构建了一种基于蛋白水平的荧光探针，并且从离体、在体以及组织水平均证明，此荧光探针的C结构域可被具有MMP2和MT1-MMP阳性细胞的MMPs蛋白水解，发生断裂，释放出I-C片段，从而启动了带有荧光标记的TM-F片段对细胞膜的标记。即：通过鉴别肿瘤细胞的MMP2和MT1-MMP活性的大小，探针具有评价肿瘤细胞的侵袭和转移活性大小的特性。
　　这一研究的成功也为利用正电子发射体层摄影技术和光学成像设备进行肿瘤恶性程度评定的新的成像探针的设计开启了大门。

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前言

文献回顾

1．基质金属蛋白酶和肿瘤的侵袭和转移

2．光学荧光探针的构建

正文

实验一 标记 MMP-2 和 MT1-MMP 阳性细胞的荧光探针的制备

1 材料

2 方法

3．结果

4．讨论

实验二 细胞膜的 MMP 依赖性探针标记

实验三 移植瘤中 MMP2 和 MT1-MMP 阳性细胞的光学成像

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

实验四 肿瘤内 MMP2 和 MT1-MMP 活性的定量分析

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

实验五 移植瘤侵润前沿的光学成像

1.材料

2.方法

3.结果

4.讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢