降解羽毛的嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ--1角蛋白酶基因kerF真核表达及酶学性质研究

摘要

嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1（Stenotrophomonas maltophilia YHYJ-1）是一株从羽毛加工厂污泥中分离到的具有很强的降解羽毛的能力的革兰氏阴性菌。本研究以嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1所产角蛋白酶为研究对象，研究了菌株的产酶条件、角蛋白酶纯化;克隆了角蛋白酶kerF基因，经密码子优化构建毕赤酵母表达载体pPIC9K-kerF，研究了重组角蛋白酶的功能表达及酶学性能。主要结果如下。 1.菌株YHYJ-1产角蛋白酶纯化及酶学性能研究。研究了培养基初始pH5.5、7.0和8.0条件下YHYJ-1生长及产酶性能。结果表明，pH5.5处理菌株生长缓慢，单位体积活细胞数量较低;培养基pH7.0和8.0处理菌株生长速度快、培养液粗酶活性显著高于pH5.5处理。利用硫酸铵分级沉淀和交联葡聚糖G-100凝胶柱纯化了YHYJ-1所产角蛋白酶，纯化的角蛋白酶经SDS-PAGE蛋白电泳分析分子量为48.3kDa。该酶最适反应温度和最适pH值分别为50℃和9.0，30～40℃具有较好的温度稳定性，60℃酶活下降很快;在pH7.0～9.5的范围内具有较好的稳定性。金属离子Ni2+、Zn2+对角蛋白酶具有明显抑制作用，Cu2+、 Fe2+、 Fe3+能完全抑制酶活;1％巯基乙醇对酶具有明显激活作用。蛋白酶抑制剂二苯基甲基磺酰氟(PFSM)和乙二胺四乙酸(EDTA)对该角蛋白酶几乎完全抑制，可判定该酶是丝氨酸金属蛋白酶。纯化的角蛋白酶能广泛降解各类蛋白质包括羽毛粉、头发、羊毛和牛血清白蛋白，上述底物与纯化的角蛋白酶共同培养，与可溶性角蛋白相比对应酶活分别是83.3％、72.9％、25.0％、95.8％。 2.角蛋白酶kerF基因克隆与功能表达。克隆了kerF基因(GenBank登录号HM590650)，经密码子优化构建毕赤酵母表达载体pPIC9K-kerF。将重组表达质粒SalⅠ酶切线性化，电转化毕赤酵母宿主菌GS115，经MD平板及YPD G418抗性平板筛选后，挑取阳性克隆进行PCR鉴定，获得重组酵母菌株pPIC9K-kerF/GS115。对阳性重组菌进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE、 Western-blot分析，结果表明kerF蛋白在毕赤酵母中获得分泌表达。 3.重组角蛋白酶KerF纯化及酶学性能研究。利用硫酸铵分级沉淀和Ni+螯和层析柱纯化了重组角蛋白酶KerF，经SDS-PAGE蛋白电泳分析分子量为65.8kDa。KerF最适反应温度和最适pH值分别为50℃和9.0。该酶在30℃温度稳定性相对较好，温度超过35℃随温度升高酶活迅速下降，至50℃酶活稳定性非常差，30min几乎完全失去活性。pH稳定性研究表明，KerF在pH6.5～9.5的范围内具有较好的稳定性。金属离子Mn2+、Co2+、Ni2+对角蛋白酶具有明显抑制作甩，Zn2+、Cu2+、 Fe2+、 Fe3+能完全抑制酶活;1％巯基乙醇对酶具有明显激活作用。PFSM和EDTA能强烈抑制该酶活性。重组角蛋白酶KerF为丝氨酸金属蛋白酶。KerF对不同种类的角蛋白质包括可溶性角蛋白、羽毛粉、头发、羊毛和牛血清白蛋白均具有一定程度的降解作用。在与重组角蛋白酶KerF共同培养时，羽毛粉、头发、羊毛和牛血清白蛋白为底物对可溶性角蛋白酶(100％)的相对酶活分别为39.2％、40.5％、35.2％、77.0％。 本研究首次成功实现了嗜麦芽窄食单胞菌（S.maltophilia）角蛋白酶基因在真核表达系统中的异源表达。重组角蛋白酶KerF具有广泛的角蛋白质底物降能力，其性能与已报道的源于其它种属的角蛋白酶不同，可判定为新的角蛋白酶。本研究对阐明角蛋白质的降解机理起到重要作用。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 研究目的与意义

1．2 角蛋白酶研究现状

1．2．1 产角蛋白酶的微生物

1．2．2 角蛋白酶

1．2．3 角蛋白酶分子生物学研究进展

1．3 毕赤酵母表达系统的研究概况

1．3．1 毕赤酵母表达表达系统的特点

1．3．2 毕赤酵母表达表达系统的组成

1．4 影响外源基因在毕赤酵母系统中高效表达的因素

1．4．1 密码子的偏爱性的影响

1．4．2 mRNA5’非翻译区以及信号肽序列的影响

1．4．3 外源基因拷贝数的影响

1．4．4 糖基化位点对外源蛋白表达量影响

1．4．5 培养条件对外源蛋白表达量的影响

1．4．6 诱导剂甲醇浓度以及启动子对外源蛋白表达量的影响

1．4．7 蛋白酶抑制剂对外源蛋白表达量的影响

第二章 降解羽毛的嗜麦芽窄食单胞菌YHYJ-1角蛋白酶纯化及酶学性质研究

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 主要试剂及其配制

2．1．3 仪器与设备

2．1．4 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 培养基pH对菌株生长及产酶性能的影响

2．2．2 角蛋白酶的纯化

2．2．3 最适反应温度和温度稳定性

2．2．4 最适pH值及pH值稳定性

2．2．5 金属离子、有机溶剂、蛋白酶抑制剂对角蛋白酶活性的影响

2．2．6 含硫化合物对角蛋白酶的影响

2．2．7 角蛋白酶底物特异性

2．3 讨论

第三章 嗜麦芽窄食单胞菌角蛋白酶基因KerF真核表达研究

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．1 角蛋白酶kerF基因PCR扩增

3．2．2 重组质粒pMD18-KerF的酶切鉴定

3．2．3 角蛋白酶kerF基因密码子改造研究

3．2．4 重组质粒提取验证

3．2．5 重组质粒双酶切验证

3．2．6 毕赤酵母细胞的电击转化

3．2．7 转化重组子验证

3．2．8 重组角蛋白酶基因在毕赤酵母中的表达及纯化

3．3 结论

第四章 重组角蛋白酶kerF结构预测及生物信息学分析

4．1 编码氨基酸分析

4．2 角蛋白酶基因序列同源性比对

4．3 编码蛋白的物理化学性质分析

4．4 信号位点分析

4．5 糖基化位点预测

4．6 编码蛋白三级结构预测

第五章 重组角蛋白酶KerF酶学性质研究

5．1 材料与方法

5．1．1 试验菌株及培养基

5．1，2 主要试剂

5．1．3 测定方法

5．2 结果与分析

5．2．1 最适反应温度和温度稳定性

5．2．2 最适pH值及pH值稳定性

5．2．3 金属离子、有机溶剂、蛋白酶抑制剂对角蛋白酶活性的影响

5．2．4 角蛋白酶底物特异性测定

5．3 小结

第六章 讨论

参考文献

致谢

附：硕士期间发表论文

授权发明专利